一种通用性的提高逆转录效率的方法技术

技术编号：40979872 阅读：2 留言：0更新日期：2024-04-18 21:26

本申请涉及生物化学与分子生物学领域，特别涉及一种通用性的提高逆转录效率的方法。本申请提供一种利于提高逆转录效率的方法，包括以下步骤：1)根据逆转录模板RNA序列设计引物；2)将逆转录缓冲液、引物、模板配制成逆转录预混体系；3)将配制逆转录预混体系进行变性、梯度退火，得到中间产物；4)将中间产物与逆转录酶混合成逆转录体系，孵育，完成逆转录。本申请通过设定特定的引物长度和变性温度，并且采用梯度退火的方式，结合预变性再与逆转录酶孵育的步骤，得到了一种适用于提高RNA逆转录效率的方法。

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【技术实现步骤摘要】

本申请涉及生物化学与分子生物学领域，特别涉及一种通用性的提高逆转录效率的方法。

技术介绍

1、逆转录(reverse transcription)是以rna为模板合成dna的过程，即rna指导下的dna合成。此过程中，核酸合成与转录(dna到rna)过程与遗传信息的流动方向(rna到dna)相反，故称为逆转录。人们通过体外模拟该过程，以样本中提取的mrna为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cdna，构建cdna文库，并从中筛选特异的目的基因。该方法已成为基因工程技术中最常用的获得目的基因的策略之一。

2、逆转录过程由逆转录酶催化，此酶也称依赖rna的dna聚合酶(rddp)，可以rna或单链dna为模板，从引物开始催化合成互补的dna链。合成的dna链称为与rna或与单链dna模板互补的dna(complementary dna,cdna)。然而，当模板是中长链rna时，其在逆转录过程的作用温度下(通常为42℃)难以自发与引物结合，因逆转录酶发挥聚合作用的前提条件是引物与rna结合，因此这种情况下，逆转录效率降低，cdna的产率低。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本申请的目的在于提供一种通用性的提高逆转录效率的方法，可实现高效的逆转录效率，从而解决现有技术中逆转录效率低的问题。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本申请第一方面提供一种利于提高逆转录效率的方法，包括以下步骤：

3、1)根据逆转录模板rna序列设计引物；

4、2)将逆转录缓冲液、引物、模板配制成逆转录预混体系；

5、3)将配制逆转录预混体系进行变性、梯度退火，得到中间产物；

6、4)将中间产物与逆转录酶混合成逆转录体系，孵育，完成逆转录。

7、在本申请的一些实施方式中，步骤1)中，所述引物长度为10～40个碱基；优选地，引物长度为20～30个碱基。

8、在本申请的一些实施方式中，步骤1)中，引物熔解温度为40～65℃；优选地，引物熔解温度为55～60℃。

9、在本申请的一些实施方式中，步骤1)中，逆转录模板rna的长度为500～12000个碱基。

10、在本申请的一些实施方式中，步骤2)中，逆转录预混体系中还包括dntp和/或rnase-free h2o。

11、在本申请的一些实施方式中，步骤3)中，变性的温度为40～80℃；优选地，变性的温度为70℃；和/或，变性的时间为1～10min；优选地，变性的时间为5min。

12、在本申请的一些实施方式中，步骤3)中，梯度退火是指从变性温度开始每降低10℃退火3～5min；梯度退火包括2～3个梯度。

13、在本申请的一些实施方式中，步骤3)中，梯度退火后还包括保温步骤，所述保温的温度为25～30℃，所述保温的时间为3～5min。

14、在本申请的一些实施方式中，步骤4)中，所述逆转录酶选自protoscript ii逆转酶、superscripttmii逆转录酶、鸟肺白血病病毒(amv)逆转录酶、m-mulv逆转录酶。

15、在本申请的一些实施方式中，步骤4)中，所述逆转录体系还包括dtt和rnase-freeh2o。孵育的温度为40～45℃；孵育的时间为1～1.5h。

16、在本申请的一些实施方式中，可选地，完成逆转录后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(dpage)检测逆转录效率，通过条带的亮度进行判断。

17、与现有技术相比，本申请的有益效果为：

18、本申请通过设定特定的引物长度和变性温度，并且采用梯度退火的方式，结合预变性再与逆转录酶孵育的步骤，得到了一种适用于提高rna逆转录效率的方法。

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【技术保护点】

1.一种利于提高逆转录效率的方法，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述引物长度为10～40个碱基；优选地，引物长度为20～30个碱基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，引物熔解温度为40～65℃；优选地，引物熔解温度为55～60℃。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，逆转录模板RNA的长度为500～12000个碱基。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，逆转录预混体系中还包括dNTP和/或RNase-free H2O。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，变性的温度为40～80℃；优选地，变性的温度为70℃；和/或，变性的时间为1～10min；优选地，变性的时间为5min。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，梯度退火是指从变性温度开始每降低10℃退火3～5min；梯度退火包括2～3个梯度；

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述逆转录酶选自ProtoScri

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述逆转录体系还包括DTT和RNase-free H2O；和/或，所述孵育的温度为40～45℃；所述孵育的时间为1～1.5h。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，可选地，完成逆转录后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测逆转录效率，通过条带的亮度进行判断。

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【技术特征摘要】

1.一种利于提高逆转录效率的方法，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述引物长度为10～40个碱基；优选地，引物长度为20～30个碱基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，引物熔解温度为40～65℃；优选地，引物熔解温度为55～60℃。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，逆转录模板rna的长度为500～12000个碱基。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，逆转录预混体系中还包括dntp和/或rnase-free h2o。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，变性的温度为40～80℃；优选地，变性的温度为70℃；和/或，变性的时间为1～10min；...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏凯，周婷，赵建龙，
申请(专利权)人：上海前瞻创新研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：

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