禽流感H10N3亚型病毒双重PCR检测的引物组、试纸盒及方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，目的是提供一种禽流感H10N3亚型病毒双重PCR检测的引物组、试剂盒及方法。本发明专利技术的引物组和检测方法通过一次PCR反应便可同时确定样品中H10与N3亚型AIV的混合感染及单一感染情况，该方法同时具有特异性强，检测灵敏度高，快速简便及易于操作等优点，十分适于在基层单位应用推广，为H10Nx与HyN3亚型AIV的监测及其防控提供技术支撑。技术支撑。技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
禽流感H10N3亚型病毒双重PCR检测的引物组、试纸盒及方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，更具体地说，它涉及一种禽流感H10N3亚型病毒双重PCR检测的引物组、试纸盒及方法。

技术介绍

[0002]禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)通过感染家禽和溢出到人类造成重大经济损失，对公共卫生安全造成严重威胁。2021年6月1日我国通报了全球首例人感染H10N3事件，引发广泛关注。此次引发人感染的H10N3为新型重组病毒，HA和NA基因分别来自于H10N8和H7N3。HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为Ω，表明其为低致病性禽流感。HA蛋白的受体结合位点具有226Q和228S，提示禽样受体和人样受体具有双重结合特异性。内部基因来源于S基因型(G57)H9N2，与导致人类致命感染的H5N6、H7N9和H10N8一致。在我国活禽市场同样分离到多株和人源毒株高度同源的禽源H10N3病毒，表明在发生人感染事件之前H10N3已在我国家禽中流行，且新型重组H10N3病毒的生物学特性表明其对公共卫生安全造成较大威胁。因此，为了有效地防制H10N3亚型AIV在家禽中的流行，及时准确地掌握流行中疫情疫病状况及防止再次发生人感染事件，迫切需要开发特异性强、灵敏度高、简便快速的检测方法，加强对禽流感病毒的监测和防控。
[0003]聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，广泛应用于分子生物学研究和临床诊断。传统的PCR应用通常专注于每个反应的单一PCR检测，而多重聚合酶链反应多重PCR应用则是在同一反应中用多对引物扩增不同的核酸靶点，缩短了核酸的检出时间，提高了检测效率。
[0004]目前，针对禽流感H10N3亚型的双重PCR核酸检测方法未见报道。因此，一种快速、简便和特异性好的针对H10N3亚型AIV检测的引物组、试剂盒及方法亟待专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了解决上述的不足，从而专利技术一种针对H10Nx亚型和HyN3亚型AIV双重PCR检测的引物组、试剂盒及方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种禽流感H10N3亚型病毒双重PCR检测的引物组，包括引物H10
‑
F、引物H10
‑
R、引物N3
‑
F及引物N3
‑
R；
[0008]所述引物H10
‑
F的核苷酸序列为：5'
‑
GGACATTGGTACAGCCAGGT
‑
3'；
[0009]所述引物H10
‑
R的核苷酸序列为：5'
‑
CTTGTAATCAGCGGCTTGGC
‑
3'；
[0010]所述引物N3
‑
F的核苷酸序列为：5'
‑
ATGATTGCTGGTCCTTCGCC
‑
3'；
[0011]所述引物N3
‑
R的核苷酸序列为：5'
‑
CCTGGGGGTGTCTGAATGAA
‑
3'。
[0012]含有上述引物组的试剂或试剂盒属于本专利技术的保护范围。
[0013]本专利技术提供了上述引物组在禽流感H10N3亚型病毒双重PCR检测的方法。
[0014]上述方法，进一步包括以下步骤：
[0015]S1：提取待测样品的cDNA；
[0016]S2：建立双重PCR反应体系，利用上述引物组进行双重PCR反应；
[0017]S3：将PCR反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，当样品扩增出407bp和602bp条带时，说明该样品为H10N3亚型AIV；当样品只扩增出407bp条带时，说明该样品为H10Nx(x≠3)亚型AIV；当样品只扩增出602bp时，说明该样品为HyN3(y≠10)亚型AIV。
[0018]进一地，步骤S2中的所述双重PCR反应体系为：2
×
Rapid Taq Master Mix12.5μL，引物N3
‑
F、N3
‑
R(10μM)各加入1μL，引物H10
‑
F、H10
‑
R(10μM)各加入0.4μL，待测样品cDNA模板1μL，加入无酶水补足至25μL。
[0019]进一地，步骤S2中的所述双重PCR反应的扩增程序为：95℃3mi n；进入95℃15s，58℃15s，72℃30s，设置35个循环；然后再72℃延伸5mi n，结束反应。
[0020]本专利技术还提供了上述引物组、或含有该引物组的试剂、或含有该引物组的试剂盒在检测H10和N3亚型禽流感病毒中的应用。
[0021]本专利技术的有益效果在于：
[0022]本专利技术针对现有的AIV H10N3亚型检测方法所存在的鉴定慢、灵敏度低、特异性差和难以适应流行时快速诊断等问题，提供一种操作简便、实验可靠性高、灵敏度高、特异性好的H10N3亚型AIV核酸检测方法。
[0023]本专利技术的引物组和检测方法通过一次PCR反应便可同时确定样品中H10与N3亚型AIV的混合感染及单一感染情况，该方法同时具有特异性强，检测灵敏度高，快速简便及易于操作等优点，十分适于在基层单位应用推广，为H10Nx与HyN3亚型AIV的监测及其防控提供技术支撑。
附图说明
[0024]图1是AIV H10/N3亚型PCR鉴定结果；
[0025]图2是双重PCR检测体系优化结果；
[0026]图3是双重PCR特异性试验结果；
[0027]图4是H10亚型AIV HA基因的双重PCR灵敏度检测结果；
[0028]图5是N3亚型AIV NA基因的双重PCR灵敏度检测结果；
[0029]图6是H10N3亚型AIV双重PCR灵敏度试验结果；
[0030]图7是部分临床样品检测结果。
具体实施方式
[0031]下面结合实施例对本专利技术作进一步的描述，但本专利技术要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
[0032]实施例1
[0033]本专利技术中所用材料与待测样品cDNA的合成如下：
[0034]毒株：H1N1、H3N2、H5N6、H6N6、H7N9、H9N2、H10N3亚型禽流感病毒cDNA，鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)cDNA、鸡传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitis virus,IBV)cDNA、鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)cDNA和鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)cDNA，由华南农业大学国家禽流感专业实验
室(广州)保存。
[0035]质粒：pUC57
‑
H10和pU本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种禽流感H10N3亚型病毒双重PCR检测的引物组，包括引物H10
‑
F、引物H10
‑
R、引物N3
‑
F及引物N3
‑
R；其特征在于，所述引物H10
‑
F的核苷酸序列为：5'
‑
GGACATTGGTACAGCCAGGT
‑
3'；所述引物H10
‑
R的核苷酸序列为：5'
‑
CTTGTAATCAGCGGCTTGGC
‑
3'；所述引物N3
‑
F的核苷酸序列为：5'
‑
ATGATTGCTGGTCCTTCGCC
‑
3'；所述引物N3
‑
R的核苷酸序列为：5'
‑
CCTGGGGGTGTCTGAATGAA
‑
3'。2.一种禽流感H10N3亚型病毒双重PCR检测的试剂或试剂盒，其特征在于，包含有如权利要求1所述的引物组。3.一种禽流感H10N3亚型病毒双重PCR检测的方法，其特征在于，使用了如权利要求1所述的引物组。4.根据权利要求3所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾伟新，杨芷翊，谢淑敏，王新凯，廖明，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：