定向酶标记抗体的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及免疫学检测技术领域，特别涉及定向酶标记抗体的方法及其应用。本发明专利技术通过Thiomab技术在抗体的重链CH1位置经过定向突变插入半胱氨酸残基，然后经过还原再氧化，使半胱氨酸残基中巯基游离，加SMCC活化的酶进行标记，即可得到酶定向标记的抗体，标记率可高达95％以上，制备得到的定向标记抗体能够明显降低低浓度样品的检测极限，且大大减少了假阳的概率，能够推广应用。能够推广应用。

【技术实现步骤摘要】
定向酶标记抗体的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及免疫学检测
，特别涉及定向酶标记抗体的方法及其应用。

技术介绍

[0002]酶免疫测定将酶促反应的高效率和免疫反应的高特异性有机地结合起来，可对各种分析物如蛋白、毒素、微生物等进行定量检测，是目前灵敏度高、适应性强、并在生产和临床中得到推广的免疫测定技术。在酶促化学发光免疫分析检测中，抗原或抗体酶标记物对免疫分析的灵敏度及特异性具有重要的作用，是酶促化学发光免疫分析检测中的关键试剂。
[0003]目前用于酶标记抗体制备的方法传统的主要有戊二醛法和过碘酸钠法。其中，过碘酸钠法是偶联酶和糖蛋白产率最高的方法，该法利用过碘酸钠将糖蛋白(抗体、糖基化的酶等)上的糖链基团氧化成醛基，在一定条件下与抗体结合形成席夫碱，再由硼氢化钠还原席夫碱为稳定性碳氮单键及糖蛋白分子中多余的醛基。与戊二醛法相比，过碘酸钠法的效率提高至少3～4倍。当前应用较多的有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广，被广泛的用于临床诊断和免疫测定的试剂等。
[0004]但是，由于抗体表面存在多个交联位点，因此，过碘酸钠标记法存在交联位点多、非定点偶联、聚体过大或不均一等问题，导致个别特殊项目在进行免疫学检测时易出现异常样本(假阳)、测试梯度差、跳孔等问题。因此，急需开发一种定点、聚体小且均一、工艺稳定的酶标记抗体的方法，以克服上述问题。
[0005]抗体偶联药物(Antibody
‑
Drug Conjugate，ADC)是通过连接子(linker)将具有生物活性的小分子药物偶联至单克隆抗体(单抗)上而产生的。目前绝大部分ADC是由靶向肿瘤抗原的抗体通过连接子与高效细胞毒性的小分子化学药物偶联而成，利用抗体与靶抗原特异性结合的特点，将小分子药物靶向递送至肿瘤细胞进而发挥杀伤肿瘤的作用。定点偶联技术是通过控制抗体上可被偶联的位点位置来实现药物偶联的位置的，其中Thiomab技术为一种经典的定点偶联技术，最早由Genentech公司的Junutula等报道，采用基因工程技术在曲妥珠单抗(trastuzumab)的轻链V110C和重链A114C特定位置处插入半胱氨酸残基，然后将半胱氨酸上的巯基和单甲基auristatinE(MMAE)偶联，合成了位点专一的抗体
‑
药物偶联物。但是现有定点偶联技术主要在ADC领域，主要连接分子多为小分子药物，尚未实现定点偶联辣根酶等大分子蛋白，并且尚未有报道将其用于免疫测定技术中。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了定向酶标记抗体的方法及其应用，本专利技术酶定向标记的抗体，标记率可高达95％以上，制备得到的定向标记抗体能够明显降低低浓度样品的检测极限，且大大减少了假阳的概率。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了酶标记抗体的制备方法，包括如下步骤：
[0009]步骤(1)：将半胱氨酸插入抗体的CH1，或使抗体CH1上任一残基突变为半胱氨酸，获得突变抗体；
[0010]步骤(2)：取酶与活化剂进行反应，获得活化酶；
[0011]步骤(3)：步骤(1)所述的突变抗体经还原、氧化，与步骤(2)所述活化酶交联，获得所述酶标记抗体。
[0012]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法中步骤(2)中：
[0013]所述反应包括取所述活化剂与所述酶以摩尔比1:10～30混合，20～30℃反应3～5h；
[0014]所述反应之后还包括取所述活化酶在PBS缓冲液中透析5～14h的步骤；
[0015]所述活化剂包括4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐或琥珀酰亚胺4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧基
‑
(6
‑
氨基己酸)；
[0016]所述酶的浓度为4～16mg/mL；和/或
[0017]所述活化剂的浓度为2～5mg/mL；和/或
[0018]所述反应中的缓冲液包括浓度为0.01M、pH为7.2的PBS缓冲液；和/或
[0019]所述反应过程中的pH为7.75～8.0。
[0020]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法中步骤(3)所述还原包括：取还原剂与所述突变抗体混合，20～30℃反应3～6h，透析12～14h去除残余还原剂；
[0021]所述还原剂与所述突变抗体的的摩尔比为(10～80):1；和/或
[0022]所述还原剂的浓度为2～5mg/mL；和/或
[0023]所述还原剂包括三(2
‑
羧乙基)膦或二硫苏糖醇；和/或
[0024]所述突变抗体的浓度为2～5mg/mL；和/或
[0025]所述突变抗体的溶剂包括浓度为0.01M、pH为7.2的PBS缓冲液；和/或
[0026]所述透析所用的透析液包括浓度为0.01M、pH为7.2的PBS缓冲液。
[0027]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法中步骤(3)中：
[0028]所述氧化包括：取经过所述还原之后的突变抗体与氧化剂混合，20～30℃反应3～6h，透析去除残余氧化剂；
[0029]所述氧化剂与所述突变抗体的的摩尔比为(20～80):1；和/或
[0030]所述氧化剂的浓度为2～5mg/mL；和/或
[0031]所述氧化剂包括脱氢抗坏血酸；和/或
[0032]所述突变抗体的浓度为2～5mg/mL；和/或
[0033]所述透析所用的透析液包括浓度为0.01M、pH为7.2的PBS缓冲液；和/或
[0034]所述交联的温度为20～30℃；和/或
[0035]所述活化酶与所述突变抗体的摩尔比包括(1.5～5):1；和/或
[0036]所述交联的时间为3～14h；和/或
[0037]所述交联的pH为8～9；和/或
[0038]所述交联之后还包括取所述酶标记抗体进行透析10～14h的步骤。
[0039]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法中步骤(1)所述抗体包括心肌肌钙蛋白I抗体、人促甲状腺激素受体抗体、甲状腺素抗体、三碘甲状原氨酸抗体或CA724抗体；和/或
[0040]所述抗体CH1上任一残基包括抗体CH1上第一个氨基酸；和/或
[0041]步骤(2)所述酶包括辣根过氧化物酶。
[0042]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法中所述抗体包括单克隆抗体；
[0043]所述单克隆抗体包括鼠源单克隆抗体、兔源单克隆抗体、羊源单克隆抗体、人源单克隆抗体或嵌合型单克隆抗体。
[0044]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法中步骤(1)所述抗体为抗心肌肌钙蛋白I鼠源单克隆抗体、抗人促甲状腺本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.酶标记抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤(1)：将半胱氨酸插入抗体的CH1，或使抗体CH1上任一残基突变为半胱氨酸，获得突变抗体；步骤(2)：取酶与活化剂进行反应，获得活化酶；步骤(3)：步骤(1)所述的突变抗体经还原、氧化，与步骤(2)所述活化酶交联，获得所述酶标记抗体。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中：所述反应包括取所述活化剂与所述酶以摩尔比1:10～30混合，20～30℃反应3～5h；所述反应之后还包括取所述活化酶在PBS缓冲液中透析5～14h的步骤；所述活化剂包括4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐或琥珀酰亚胺4
‑
(N
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马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧基
‑
(6
‑
氨基己酸)；所述酶的浓度为4～16mg/mL；和/或所述活化剂的浓度为2～5mg/mL；和/或所述反应中的缓冲液包括浓度为0.01M、pH为7.2的PBS缓冲液；和/或所述反应过程中的pH为7.75～8.0。3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述还原包括：取还原剂与所述突变抗体混合，20～30℃反应3～6h，透析12～14h去除残余还原剂；所述还原剂与所述突变抗体的的摩尔比为(10～80):1；和/或所述还原剂的浓度为2～5mg/mL；和/或所述还原剂包括三(2
‑
羧乙基)膦或二硫苏糖醇；和/或所述突变抗体的浓度为2～5mg/mL；和/或所述突变抗体的溶剂包括浓度为0.01M、pH为7.2的PBS缓冲液；和/或所述透析所用的透析液包括浓度为0.01M、pH为7.2的PBS缓冲液。4.如权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中：所述氧化包括：取经过所述还原之后的突变抗体与氧化剂混合，20～30℃反应3～6h，透析去除残余氧化剂；所述氧化剂与所述突变抗体的的摩尔比为(20～80):1；和/或所述氧化剂的浓度为2～5mg/mL；和/或所述氧化剂包括脱氢抗坏血酸；和/或所述突变抗体的浓度为2～5mg/mL；和/或所述透析所用的透析液包括浓度为0.01M、pH为7.2的PBS缓冲液；和/或所述交联的温度为20～30℃；和/或所述活化酶与所述突变抗体的摩尔比包括(1.5～5):1；和/或所述交联的时间为3～14h；和/或所述交联的pH为8～9；和/或所述交联之后还包括取所述酶标记抗体进行透析10～14h的步骤。5.如权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述抗体包括心肌肌钙蛋白I抗体、人促甲状腺激素受体抗体、甲状腺素抗体、三碘甲状原...

【专利技术属性】
技术研发人员：常宁杰，李昕益，高志阳，徐延伟，张春鸽，崔亚敏，董艳娜，赵巧辉，李桂林，付光宇，杨增利，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：