一种阿拉斯加犬脾脏肿瘤细胞系及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种阿拉斯加犬脾脏肿瘤细胞系及其构建方法，所述方法包括以下步骤：将阿拉斯加犬的脾脏肿瘤组织进行消化，得到肿瘤细胞；细胞生长至培养皿85

【技术实现步骤摘要】
一种阿拉斯加犬脾脏肿瘤细胞系及其构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种阿拉斯加犬脾脏肿瘤细胞系及其构建方法。

技术介绍

[0002]体外培养肿瘤细胞是研究肿瘤细胞生物学特性、癌变机理和癌症治疗的良好生物学模型。肿瘤细胞系的常规建立方法是应用肿瘤组织进行培养，如果在体外长期培养获得不死，即为永生化的肿瘤细胞系。另外一种肿瘤细胞系的建立方法是对正常细胞进行培养，然后在细胞中导入癌基因如端粒酶基因、SV40大T抗原、myc基因和人类乳头瘤病毒基因等，细胞才能长期存活，获得不死性，使细胞获得恶性表型。但以上两种建立永生化的肿瘤细胞系的方法成功率都比较低。另外，体外长期培养的人类成年正常细胞也能够发生恶性转化形成肿瘤，但这种恶性转化机率较低，同样无法被广泛的采用。
[0003]脾脏是重要的免疫器官，具有很强大的免疫功能，脾脏可以分泌多种抗肿瘤物质促进抗肿瘤免疫。目前科研工作者们主要集中于研究人类免疫系统发育及疾病治疗和诊断，对于犬科动物的免疫研究比较少，特别是对于犬科脾脏的研究更是少之又少。所以，建立一种犬类脾脏肿瘤细胞系的体外培养方法对犬科动物具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术为了解决上述技术问题，提供了一种阿拉斯加犬脾脏肿瘤细胞系及其构建方法。
[0005]本专利技术是采用以下技术方案得有实现的。
[0006]一种阿拉斯加犬脾脏肿瘤细胞系的构建方法，包括以下步骤：
[0007]S1.将阿拉斯加犬的脾脏肿瘤组织进行消化，得到肿瘤细胞；<br/>[0008]S2.细胞生长至培养皿85
‑
90％时，进行传代培养；
[0009]S3.在体外培养2
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6个月后，培养物中出现增殖旺盛的克隆，细胞获得不死性，恶性转化为肿瘤细胞；
[0010]S4.恶性转化后经过4
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30次传代后，应用有限稀释单克隆法获得单克隆的细胞株；
[0011]S5.采用分子生物学方法和组学方法对肿瘤细胞进行鉴定；
[0012]S6.将获得不死性的细胞裸鼠皮下注射，证明其致瘤性。
[0013]进一步的，步骤S1中，剥取阿拉斯加犬脾脏肿瘤组织，采用胶原酶Ⅳ进行消化，将消化后的组织进行研磨并过滤，获得的细胞进行培养。
[0014]进一步的，阿拉斯加犬的脾脏肿瘤组织来源于6周龄阿拉斯加犬的脾体肿瘤。
[0015]进一步的，步骤S3中，体外培养的时间为3
‑
5个月。
[0016]进一步的，步骤S4中，有限稀释单克隆法的具体方法为：
[0017]a.对细胞进行稀释，使得细胞终浓度为1个细胞/100ul，将细胞加入96孔细胞培养板中，使得1孔/100ul，倒置显微镜下观察并找出含有1个细胞的培养孔做好标记；
[0018]b.培养3
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5天，给含有1个细胞的培养孔进行换液，继续培养，每隔4天给细胞更换一次培养基；
[0019]c.培养到第4周时，胰酶消化，收集细胞转入48孔细胞培养板中，隔天给细胞换液；
[0020]d.待细胞在48孔培养板中生长至85
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90％时，胰酶消化转入24孔板中，隔天给细胞换液；
[0021]e.待细胞在24孔培养板中生长至85
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90％时，胰酶消化转入12孔板中，隔天给细胞换液；
[0022]f.待细胞在12孔培养板中生长至85
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90％时，胰酶消化转入6孔板中，隔天给细胞换液；
[0023]g.待细胞在6孔培养板中生长至85
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90％时，胰酶消化转入6cm细胞培养皿中，隔天给细胞换液；
[0024]h.待细胞在6cm培养皿中生长至85
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90％时，胰酶消化转入10cm细胞培养皿中，隔天给细胞换液；
[0025]i.待细胞在10cm培养皿中生长至85
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90％时，用胰酶消化，收集细胞。
[0026]进一步的，所述培养基为含10％胎牛血清的DMEM培养基。
[0027]一种上述方法培养得到的阿拉斯加犬脾脏肿瘤细胞系。
[0028]本申请具有以下有益效果。
[0029]本专利技术方法是将阿拉斯加犬的脾脏巨大肿瘤细胞进行原代培养和传代培养，利用胶原酶消化法制备原代细胞，经体外培养数月，利用有限稀释法建立单克隆细胞株。期间采用PCR方法鉴定细胞种属、组学方法鉴定肿瘤细胞特异性marker，小鼠成瘤实验证明其致瘤性。本专利技术方法能够简单、快速建立永生化犬脾脏肿瘤细胞系，比传统肿瘤细胞建立方法简单、省时、省力，而且是一种利用分子生物学和组学结合的手段建立的阿拉斯加犬脾脏肿瘤细胞株。所建立新的犬脾脏肿瘤细胞株对于犬脾脏肿瘤发病机制的研究、免疫系统的研究和犬肿瘤药物的筛选有广泛的应用前景。
附图说明
[0030]图1是显微镜下(10X)胰酶消化后刚传代完毕的细胞形态示意图；
[0031]图2是显微镜下(10X)体外长期培养的细胞形态示意图；
[0032]图3是细胞在不同培养基中的细胞生长曲线图；
[0033]图4是细胞在不同浓度胎牛血清中的细胞生长曲线图；
[0034]图5是支原体检测结果图(其中，A：D10FUV200X；B.D10F明场200X；C.VEROUV200X；D.VERO明场200X；E.047A
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D3UV200X；F.047A
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D3明场200X；G.047A
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E4UV200X；H.047A
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E4明场200X)；
[0035]图6是细胞种属鉴定结果图；
[0036]图7是小鼠皮下移植后4周解剖得到的肿瘤组织示意图。
具体实施方式
[0037]下面结合实施例对本专利技术进行进一步的说明。
[0038]一、方法
[0039]1建系过程
[0040]阿拉斯加犬6周龄组织的获取得到家属和宠物医生的同意。
[0041]1.1在细胞间的生物安全柜中用剪刀和镊子剥取脾脏肿瘤组织，所取组织大小在2*2cm左右，将组织在含有3倍双抗的PBS中清洗3
‑
4遍，剪成0.5mm3左右的小组织块，将小组织块转移进入无菌的15ml离心管中，并加入250X的胶原酶Ⅳ，置于摇床中200rpm,37℃摇30分钟；
[0042]1.2取出装有小组织块的15ml离心管，经75％酒精喷洒离心管表面后放入超净台中；同时准备1个干净的50ml离心管，拧开盖子，在管子上方放入一个40um细胞筛,同时加入1ml含有3倍双抗的PBS浸润40um细胞筛；
[0043]1.3吸取将胶原酶Ⅳ消化过后的组织块加入浸润后的40um细胞筛上方，再准备一个1ml无菌注射器，用注射器的柱塞对组织块进行研磨，同时整个过程要在40um细胞筛上加入含有3倍双抗的PBS，这样研磨的细胞就可以伴随PBS一起流本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种阿拉斯加犬脾脏肿瘤细胞系的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：S1.将阿拉斯加犬的脾脏肿瘤组织进行消化，得到肿瘤细胞；S2.细胞生长至培养皿85
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90％时，进行传代培养；S3.在体外培养2
‑
6个月后，培养物中出现增殖旺盛的克隆，细胞获得不死性，恶性转化为肿瘤细胞；S4.恶性转化后经过4
‑
30次传代后，应用有限稀释单克隆法获得单克隆的细胞株；S5.采用分子生物学方法和组学方法对肿瘤细胞进行鉴定；S6.将获得不死性的细胞裸鼠皮下注射，证明其致瘤性。2.根据权利要求1所述的一种阿拉斯加犬脾脏肿瘤细胞系的构建方法，其特征在于：步骤S1中，剥取阿拉斯加犬脾脏肿瘤组织，采用胶原酶Ⅳ进行消化，将消化后的组织进行研磨并过滤，获得的细胞进行培养。3.根据权利要求1或2所述的一种阿拉斯加犬脾脏肿瘤细胞系的构建方法，其特征在于：阿拉斯加犬的脾脏肿瘤组织来源于6周龄阿拉斯加犬的脾体肿瘤。4.根据权利要求1所述的一种阿拉斯加犬脾脏肿瘤细胞系的构建方法，其特征在于：步骤S3中，体外培养的时间为3
‑
5个月。5.根据权利要求1所述的一种阿拉斯加犬脾脏肿瘤细胞系的构建方法，其特征在于：步骤S4中，有限稀释单克隆法的具体方法为：a.对细胞进行稀释，使得细胞终浓度为1个细胞/100ul，将细胞加入96孔细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：周云，佟季航，沈丽雅，
申请(专利权)人：卫仕宠物营养研究院芜湖有限公司，
类型：发明
国别省市：