利用脂亲和多肽pHLIP无偏向分离与富集细胞外囊泡的应用制造技术

本发明专利技术涉及利用脂亲和多肽pHLIP无偏向分离与富集细胞外囊泡的应用，属于生物技术领域。本发明专利技术首次提出了利用pHLIP与sEVs脂质双分子层的相互作用，从生物样品中无偏向分离与富集sEVs的方法。与经典的超速离心法相比，该方法简单快速，高效，成本低，整个分离过程中无需使用大型仪器，且本发明专利技术无需其他抗体、适配体的修饰，具有较好的临床应用前景。具有较好的临床应用前景。具有较好的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】
利用脂亲和多肽pHLIP无偏向分离与富集细胞外囊泡的应用


[0001]本专利技术属于生物
，更具体地，涉及利用脂亲和多肽pHLIP无偏向分离与富集细胞外囊泡的应用。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(sEVs)，是细胞分泌的一类囊泡物质，它含有磷脂双分子层结构，广泛分布于各种体液中。其中，人们将尺寸介于30
‑
200nm的细胞外囊泡，定义为外泌体。由于sEVs含量较高，并在所有生理和疾病阶段都持续存在，同时sEVs固有的稳定性保证了其携带的生物分子的完整性，目前，已经开发了多种技术用于sEVs的分离，包括超速离心法、聚合物沉淀等，尽管传统的sEVs分离方法在科学研究中被广泛应用，但它们不能处理微量样本、处理时间长、得到的sEVs纯度低、sEVs具有破损的风险。此外，利用抗体或核酸适配体对sEVs进行免疫捕获，由于sEVs分子组成高度异质性，传统的免疫分离方法往往会丢失低表达或无相关抗原表达的相关sEVs而丢失与肿瘤相关的重要信息。因此，临床上迫切需要建立快速、高效、无缺失的sEVs分离与富集方法。
[0003]含有36个氨基酸的pH(低)插入肽(pHLIP)(NH2‑
CAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT
‑
COOH)是从菌视紫红质的C螺旋中衍生出来的。当pH大于7时，pHLIP能与脂质双分子层表面强结合。在酸性条件下，pHLIP可穿过脂质双分子层，形成跨膜螺旋。此外，一旦pHLIP结合或插入到脂质双分子层，它对脂质双分子层的干扰较小，它们不诱导膜渗透或形成孔隙，因此，pHLIP可以与sEVs的脂质双分子层作用，无偏向分离与富集sEVs。

技术实现思路

[0004]本专利技术解决了现有技术中从标本中无偏向分离和富集含量较低sEVs存在的技术难度，本专利技术利用脂亲和多肽pHLIP与细胞外囊泡的脂质双分子层结合的能力，提供了一种pHLIP无偏向分离与富集sEVs的简便方法。该方法简单快速，高效，成本低，无偏向富集，整个分离过程中无需大型仪器。
[0005]根据本专利技术的目的，提供了一种利用脂亲和多肽pHLIP无偏向分离与富集细胞外囊泡的应用，将修饰在微纳材料表面的脂亲和多肽pHLIP与含有细胞外囊泡的样品共孵育，所述脂亲和多肽pHLIP的序列如SEQ ID NO:1所示，所述脂亲和多肽pHLIP与细胞外囊泡的脂质双分子层结合；孵育后进行离心，沉淀即为分离得到的细胞外囊泡。
[0006]优选地，所述微纳材料为磁性微球、聚苯乙烯微球、ZnO纳米材料或TiO2纳米材料。
[0007]优选地，修饰在微纳材料表面的脂亲和多肽pHLIP的具体制备方法为：先在微纳材料表面修饰聚多巴胺，然后再修饰链霉亲和素与聚多巴胺连接；在脂亲和多肽pHLIP上修饰生物素，通过链霉亲和素与生物素的作用将脂亲和多肽pHLIP修饰在微纳材料表面。
[0008]优选地，所述生物素上修饰有二硫键。
[0009]优选地，向得到的沉淀中加入二硫苏糖醇溶液或三(2
‑
羧乙基)膦，所述二硫苏糖醇溶液或三(2
‑
羧乙基)膦破坏生物素上的二硫键，使得细胞外囊泡从微纳材料上释放下
来。
[0010]优选地，将所述沉淀采用磷酸盐缓冲液进行洗涤。
[0011]优选地，所述共孵育的时间为20min～60min，温度为18℃～30℃。
[0012]总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
[0013](1)本专利技术仅通过简单的生物偶联，即可将pHLIP修饰在微纳材料表面，此修饰过程及方法简单，成本低，利用pHLIP与脂质双分子层的相互作用，能够很容易地实现sEVs无偏向分离与富集，且本专利技术无需其他抗体、适配体的修饰，无需大型仪器。
[0014](2)本专利技术由于微纳材料具有较大的比表面积，可以有更多的结合位点用于pHLIP的修饰。
[0015](3)本专利技术优选地，用带二硫键的生物素修饰pHLIP捕获sEVs，通过二硫苏糖醇或三(2
‑
羧乙基)膦与二硫键的作用，可以将捕获的sEVs无损释放，用于下游分析。
附图说明
[0016]图1为链霉亲和素修饰成功的验证。
[0017]图2为pHLIP作用于细胞膜的验证。
[0018]图3为pHLIP与细胞膜作用时间的优化。
[0019]图4为pHLIP修饰聚苯乙烯微球捕获sEVs的SEM图。
[0020]图5为pHLIP修饰聚苯乙烯微球与sEVs孵育时间对捕获效率的影响。
[0021]图6为pHLIP修饰聚苯乙烯微球对不同细胞来源sEVs的捕获效率。
[0022]图7为sEVs从pHLIP修饰聚苯乙烯微球表面释放的免疫表征：(a)为释放之前；(b)为释放之后。
[0023]图8为材料捕获到模拟样本sEVs(1μL PC9细胞来源的sEVs+99μL健康人血清)，其下游EGFR 19号外显子缺失突变的qPCR。
[0024]图9为材料捕获到模拟样本sEVs(1μL PC9细胞来源的sEVs+99μL健康人血清)，其EGFR 19号外显子缺失突变的sanger测序片段。
[0025]图10为材料捕获到病人血清sEVs，其下游EGFR 19号外显子缺失突变的qPCR。
[0026]图11为本专利技术pHLIP修饰及与细胞外囊泡结合的示意图。
具体实施方式
[0027]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0028]本专利技术无偏向分离与富集sEVs的方法，将pHLIP与血清sEVs共孵育，经洗涤、释放后获得sEVs；共孵育之前还包括将pHLIP修饰在微纳材料表面。
[0029]一些实施例中，微纳材料可包括聚苯乙烯微球，ZnO纳米材料，TiO2纳米材料等。
[0030]一些实施例中，其修饰方法之一为微纳材料表面修饰聚多巴胺，然后再修饰链霉亲和素，此外，在pHLIP短肽上修饰生物素，通过链霉亲和素与生物素的作用将pHLIP修饰在
微纳材料表面。
[0031]一些实施例中，所述共孵育的时间为20min～60min，温度为18℃～30℃。
[0032][0033]一些实施例中，所述洗涤包括以PBS溶液洗涤2次；所述释放为100μM二硫苏糖醇溶液或三(2
‑
羧乙基)膦。
[0034]本专利技术提供了在微纳材料表面修饰pHLIP的方法，包括以下步骤：
[0035](1)在微纳材料(磁性微球、聚苯乙烯、ZnO、TiO2纳米球等)表面修饰聚多巴胺；
[0036](2)在步骤(1)得到材料表面修饰链霉亲和素；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用脂亲和多肽pHLIP无偏向分离与富集细胞外囊泡的应用，其特征在于，将修饰在微纳材料表面的脂亲和多肽pHLIP与含有细胞外囊泡的样品共孵育，所述脂亲和多肽pHLIP的序列如SEQ ID NO:1所示，所述脂亲和多肽pHLIP与细胞外囊泡的脂质双分子层结合；孵育后进行离心，沉淀即为分离得到的细胞外囊泡。2.如权利要求1所述的利用脂亲和多肽pHLIP无偏向分离与富集细胞外囊泡的应用，其特征在于，所述微纳材料为磁性微球、聚苯乙烯微球、ZnO纳米材料或TiO2纳米材料。3.如权利要求1或2所述的利用脂亲和多肽pHLIP无偏向分离与富集细胞外囊泡的应用，其特征在于，修饰在微纳材料表面的脂亲和多肽pHLIP的具体制备方法为：先在微纳材料表面修饰聚多巴胺，然后再修饰链霉亲和素与聚多巴胺连接；在脂亲和多肽pHLIP上修饰生物素，通过链霉亲和素与生物素的作用...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐丽，余旭，王乐，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：