用于多交叉恒温扩增结合纳米生物传感检测肺炎支原体的引物组合和检测肺炎支原体的方法技术

本发明专利技术公开了一种多交叉恒温扩增结合纳米生物传感检测肺炎支原体的引物组合，所述引物组合能够针对肺炎支原体P1基因进行特异性扩增。本发明专利技术还公开了多交叉恒温扩增结合纳米生物传感检测肺炎支原体的方法，可以在30分钟内完成整个MCDA扩增，在其对肺炎支原体的特异性基因P1的检测中，检测下限可以低至10fg，具有非常高的灵敏度。另外，本发明专利技术提供的扩增方法具有很高的扩增特异性。在对常见的致病菌、条件致病菌及非肺炎支原体DNA的检测中，均为阴性扩增，只有肺炎支原体呈特异性扩增，说明所建立的方法具有极高的特异性，能准确地鉴定肺炎支原体，无假阳性及假阴性结果产生。无假阳性及假阴性结果产生。无假阳性及假阴性结果产生。

【技术实现步骤摘要】
用于多交叉恒温扩增结合纳米生物传感检测肺炎支原体的引物组合和检测肺炎支原体的方法
[0001]本申请是申请日为2019年03月19日、申请号为201910209767.8、专利技术名称为《多交叉恒温扩增结合纳米生物传感检测肺炎支原体的方法》的分案申请。


[0002]本专利技术属于分子生物学
，公开了一种用于多交叉恒温扩增结合纳米生物传感检测肺炎支原体的引物组合和检测肺炎支原体的方法。

技术介绍

[0003]肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是人类呼吸道感染性疾病最常见的病原体之一，也是社区获得性肺炎的主要病原体。在MP流行时期，由MP引起的社区获得性肺炎在一般人群中约占20％
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40％，而在封闭人群中可高达70％。MP感染可发生在各年龄段人群中，其中以学龄期儿童和青少年最为常见。MP感染引起的临床症状多种多样，轻者临床表现与其他病原体感染引起的非特异性症状类似，如发热、咳嗽、流涕等；重者可表现为重症肺炎、呼吸衰竭等严重的呼吸系统疾病，甚至累及中枢系统、消化系统等。β
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内酰胺类药物作用于细胞壁，是呼吸道感染性疾病经验性治疗常选药物，然而MP缺乏细胞壁，因此对作用于细胞壁的药物天然耐药。因此研发一个可用于诊断MP感染的简单、快速、敏感性和特异性较高的MP检测方法，对合理应用抗生素，有效治疗MP至关重要。
[0004]目前用于MP感染诊断的MP检测方法主要有：培养法、血清学检测、分子生物学检测。培养法是MP检测的金标准，但是该种方法并不推荐用于MP 检测，因为MP对生长条件要求苛刻、实验室要求比较高、技术人员要求比较严格，并且MP生长缓慢，需2～4周才可以获得培养结果。血清学检测因其便利性、敏感性和特异性较好而广泛用于实验室检测，但是血清学检测受采样时间，患者年龄、机体免疫状态等因素的影响，同时血清学检测结果的可靠性依赖急性期和恢复期双份血清的获取，由于恢复期血清难以获取，因此限制了血清学检测在临床上的应用。随着分子生物学技术的发展，以PCR 为基础的核酸检测技术开始广泛用于MP检测，其中Real
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time PCR是目前临床常用的MP快速检测技术。但是该检测方法依赖精密复杂的仪器，昂贵的探针，对实验室条件和技术人员要求比较高，因此该检测方法不适用于基层医院。
[0005]近年来为了克服PCR检测的不足，以恒温扩增技术为基础的核酸检测技术迅速发展。恒温扩增技术较PCR技术而言，不依赖于热循环扩增设备，仅需要水浴锅或简单的PCR仪即可，并且恒温扩增核酸检测技术具有特异性和敏感性高、操作简单、反应迅速的优点，因此恒温扩增技术可广泛用于各医疗机构。迄今为止，恒温扩增技术已有10余种，目前应用较为广泛的有滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)等。然而，这些恒温扩增技术依赖多种酶同时工作，试剂昂贵、操作复杂，在欠发达地区及快速检测
不适合推广应用。为克服PCR技术和现有的恒温扩增技术的劣势，实现简单、快速、灵敏、特异的核酸检测，专利技术人近期新建了一种核酸扩
增技术，命名为多交叉置换扩增(Multiple Cross Displacement Amplication,MCDA)，相关内容公开于CN104946744A，该专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。
[0006]MCDA在恒温条件下仅使用一种恒温置换酶实现核酸扩增，反应迅速，灵敏性和特异性高。为了使该技术更经济并且在生物、医药及卫生领域推广应用，专利技术人以MCDA为基础，将MCDA技术与纳米生物检测技术相结合，开发了依赖MCDA技术、实现快速，敏感检测的纳米生物传感技术，该技术被命名为多交叉恒温扩增结合纳米生物传感的核酸检测技术(Multiple CrossDisplacement Amplification label
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based Nanoparticles LateralFlowBiosensor,MCDA
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LFB)，相关内容公开于CN201610872509.4、CN201610942289.8和CN201610982015.1，这些专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。如何将MCDA
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LFB应用于MP的检测，针对 MP的特异基因P1设计MCDA扩增引物，快速、敏感、特异的检测MP，仍是本行业需要重点解决的问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于将MCDA
‑
LFB应用于MP的检测，针对MP的特异基因P1设计MCDA扩增引物，建立针对MP的快速、敏感、特异的MCDA
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LFB 检测体系。
[0008]基于上述目的，本专利技术首先提供了一种多交叉恒温扩增结合纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：
[0009](1)提取待检测样品的基因组；
[0010](2)提供序列如SEQ ID NO:1所示的置换引物F1和序列如SEQ ID NO:2 所示的置换引物F2，提供序列如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1和序列如 SEQ ID NO:4所示的交叉引物CP2；序列如SEQ ID NO:5所示的扩增引物C1 和序列如SEQ ID NO:6所示的扩增引物C2，序列如SEQ ID NO:7所示的扩增引物D1和序列如SEQ ID NO:8所示的扩增引物D2，序列如SEQ ID NO:9所示的扩增引物R1和序列如SEQ ID NO:10所示的扩增引物R2；其中在引物 C1或者C2的5
’
端标记半抗原，在引物D1或者D2的5
’
端标记生物素；本步骤中所设计的上述引物是针对肺炎支原体的特异性基因P1设计的；
[0011](3)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用待检测样品的基因组核酸作为模板恒温扩增DNA；本步骤中所述的扩增是以肺炎支原体的特异性基因P1的核酸序列为模板进行的；
[0012](4)使用纳米生物传感器检测步骤(3)的扩增产物。
[0013]在一个优选的技术方案中，所述在5
’
端标记半抗原的引物为C1，标记半抗原后的引物定义为C1*，在5
’
端标记生物素的引物为D1，标记生物素后的引物定为D1*。
[0014]在一个更为优选的技术方案中，在所述扩增引物C1*的5
’
端所标记的半抗原为荧光素(FITC)。
[0015]更为优选地，所述纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在结合垫、检测线及控制线区域依次包被有有色基团修饰的亲和素化的高分子纳米粒子、羊抗FITC抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。
[0016]在另一个优选的技术方案中，所述恒温扩增是在64
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于多交叉恒温扩增结合纳米生物传感检测肺炎支原体的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括置换引物、交叉引物和扩增引物；所述置换引物包括序列如SEQ ID NO:1所示的置换引物F1和序列如SEQ ID NO:2所示的置换引物F2；所述交叉引物包括序列如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1和序列如SEQ ID NO:4所示的交叉引物CP2；所述扩增引物包括序列如SEQ ID NO:5所示的扩增引物C1，序列如SEQ ID NO:6所示的扩增引物C2，序列如SEQ ID NO:7所示的扩增引物D1，序列如SEQ ID NO:8所示的扩增引物D2，序列如SEQ ID NO:9所示的扩增引物R1和序列如SEQ ID NO:10所示的扩增引物R2；其中在扩增引物C1或者C2的5
’
端标记半抗原，在扩增引物D1或者D2的5
’
端标记生物素。2.根据权利要求1所述的扩增引物，其特征在于，在所述扩增引物C1的5
’
端标记半抗原，标记半抗原后的引物定义为扩增引物C1*；在所述扩增引物D1的5
’
端标记生物素，标记生物素后的引物定为扩增引物D1*。3.根据权利要求2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：申阿东，王亚翠，焦伟伟，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京儿童医院，
类型：发明
国别省市：