一种具有成骨活性的氨基酸片段Z01及其筛选和应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种具有成骨活性的氨基酸片段Z01及其筛选和应用。本发明专利技术自建了特有针对Osx的细胞筛选平台：CL

【技术实现步骤摘要】
一种具有成骨活性的氨基酸片段Z01及其筛选和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种具有成骨活性的氨基酸片段Z01及其筛选和应用。

技术介绍

[0002]骨质疏松症(Osteoporosis)是最常见的代谢性骨病，其特征是骨量减少、骨组织微结构改变、骨强度降低和骨折风险增加。骨质疏松是因为成骨细胞与破骨细胞之间功能不平衡造成的。调控骨形成和吸收关键通路机制的发现，有助确定具有特异作用机制的新治疗方法。目前大多数骨质疏松治疗药物旨在抑制骨吸收，机制上针对破骨细胞。由于骨重建过程涉及骨形成和骨吸收，仅使用抗骨吸收类药物难以有效改善骨量及骨结构，为了更有效治疗骨质疏松，刺激新骨形成将是重要策略，机制上针对成骨细胞。市场上还没有有效直接刺激新骨形成的药物。而阐明骨形成过程的基因调控分子机制对指导骨质疏松特异性促骨形成新药的研发有重要意义。
[0003]骨形成包括膜内成骨与软骨内成骨两种方式，膜内成骨是先由间充质细胞分化成为胚性结缔组织膜，然后在此膜内成骨，颅面及锁骨即以此方式发生；软骨内成骨以预先形成的软骨为模板然后被骨组织取代的过程为特征，远较膜内成骨复杂，大多数骨如四肢、躯干及颅底骨以此方式发生。成骨细胞从间充质干细胞分化而来，经历了由不同转录因子及信号蛋白调控的多个阶段。Ihh是软骨内成骨所必需的转录因子，不参与膜内成骨，它对间充质细胞分化为成骨细胞必不可缺；转录因子Runx2参与软骨内成骨及膜内成骨调控，表达Runx2的细胞能分化为成骨细胞或软骨细胞；成骨细胞特异转录因子Osterix(Osx)是骨形成及成骨细胞分化的必要转录因子，Osx基因缺失小鼠胚胎完全没有骨形成而软骨形成不受影响。我们课题组前期研究已经发现了一些重要的Osx下游靶基因，包括VDR，SatB2，VEGF，Dkk1，Sost等，进一步确认了Osx对骨形成的重要作用。Osx直接调控成骨细胞标志基因骨涎蛋白(Bsp)。全基因组关联分析研究证实Osx与骨质疏松相关。虽然Osx与骨质疏松症表型有关，但仍需进一步研究以确定Osx在骨形成作用的分子机制，包括探索Osx上游调节因子。骨质疏松迫切需要促骨形成新药，而Osx作为骨分子开关是理想的全新靶点。
[0004]因此，开发一种促骨形成的新药是本领域至关重要的，而Osx作为全新靶点，是新药开发的关键突破口。

技术实现思路

[0005]针对现有技术普遍存在的问题，本专利技术提供了一种具有成骨活性的氨基酸片段Z01及其筛选和应用。本专利技术筛选出的Z01片段可以具有成骨活性，改善骨的微结构，增加骨密度。
[0006]本专利技术所述具有成骨活性的氨基酸片段Z01的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]SCAPGADPKSRLCALCAGDDQGLDKCVPNSKEKYYGYTGAFRCL(SEQ ID NO.1)；
[0008]本专利技术还提供了一种所述具有成骨活性的氨基酸片段Z01的筛选过程，包括如下
步骤：
[0009]S1、根据CL
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XWY
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012基因的结构及实验需求，在CL
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XWY
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012基因的2号外显子终止密码子前敲入P2A
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EGFP，以此作为靶点区域；
[0010]S2、采用PCR技术扩增靶点区域，并进行测序验证，获得扩增后的靶点区域；
[0011]S3、在靶点区域附近设计16条sgRNA，筛选活性高的2条sgRNA，同时经过酶切鉴定、测序构建打靶载体；
[0012]S4、将步骤S3筛选得到的2条sgRNA，打靶载体电转入C2C12细胞系中，经过药物筛选、阳性克隆富集、PCR筛选，获得阳性克隆CL
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Osx
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EGFP细胞株；
[0013]S5、将步骤S4获得的阳性克隆CL
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Osx
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EGFP细胞株在DMEM培养液中培养，培养至60％
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80％饱和时，用BMP2和Lactoferrin(LF)等化合物进行药物处理24小时，BMP2作为阳性对照，获得经药物处理的CL
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Osx
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EGFP细胞株；提取RNA，并反转录成cDNA，以合成的cDNA为模板，运用实时定量PCR技术对EGFP基因表达进行检测，说明LF化合物是Osx的激活剂；
[0014]S6、下一步核实LF对Osx的激活作用：C2C12间充质干细胞在DMEM细胞培养液，在37℃、95％饱和湿度的湿化空气中培养，将细胞置于6孔板中，培养至60％
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80％饱和时，用LF处理24小时，经LF处理的C2C12细胞，提取RNA，并反转录成cDNA，以合成的cDNA为模板，运用实时定量PCR技术对Osx基因表达进行检测，并进一步对LF的不同大小片段进行功能检测、筛选，即获得Z01。
[0015]优选地，步骤S3所述筛选出的活性高的2条sgRNA为CL
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XWY
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012
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sgRNA4和CL
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XWY
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012
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sgRNA14。
[0016]优选地，步骤S3所述CL
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XWY
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012
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sgRNA4对应的oligo序列如SEQ ID NO.2所示；所述CL
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XWY
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012
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sgRNA14对应的oligo序列如SEQ ID NO.3所示。
[0017]优选地，步骤S4所述的电转过程采用细胞电穿孔法，是用短暂的高场强电脉冲处理细胞，脉冲处理2次，沿细胞膜的电压差异会让电流可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促，从而使外源DNA进入细胞膜内部。
[0018]电转时，具体条件为：电转系统为Neon Transfection System(MPK5000)；脉冲电压为1400V，脉冲宽度为20，转染效率为90％，细胞活性为94.1％。
[0019]优选地，步骤S5所述的步骤S5所述的DMEM培养液为含10％胎牛血清、100U/mL青霉素G钠和100μg/mL硫酸链霉素的DMEM培养液。
[0020]本专利技术还提供了一种所述的氨基酸片段Z01在制备具有成骨活性的药物中的应用。
[0021]优选地，所述药物还包括生理盐水及药学上可接受的载体。
[0022]优选地，所述药物剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、口服液体剂型、微粒、软膏剂中的一种。
[0023]本专利技术C12
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Osx
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GFP自制筛选细胞株是用来筛选各种分子化合物的，检测EGFP的表达；而C2C12细胞是用来核实被筛选出来的分子化合物对Osx激活功能的，检测Osx的表达。前者细胞先筛选出LF，后者细胞核实LF激活Osx功能，进一步对LF的结构进行优化，最终发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有成骨活性的氨基酸片段Z01，其特征在于，所述氨基酸片段Z01的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种如权利要求1所述具有成骨活性的氨基酸片段Z01的筛选过程，其特征在于，包括以下步骤：S1、根据CL
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XWY
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012基因的结构及实验需求，在CL
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XWY
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012基因的2号外显子终止密码子前敲入P2A
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EGFP，以此作为靶点区域；S2、采用PCR技术扩增靶点区域，并进行测序验证，获得扩增后的靶点区域；S3、在靶点区域附近设计16条sgRNA，筛选活性高的2条sgRNA，同时经过酶切鉴定、测序构建打靶载体；S4、将步骤S3筛选得到的2条sgRNA，打靶载体电转入C2C12细胞系中，经过药物筛选、阳性克隆富集、PCR筛选，获得阳性克隆CL
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Osx
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EGFP细胞株；S5、将步骤S4获得的阳性克隆CL
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Osx
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EGFP细胞株在DMEM培养液中培养，培养至60％
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80％饱和时，用BMP2和Lactoferrin化合物进行药物处理24小时，BMP2作为阳性对照，获得经药物处理的CL
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Osx
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EGFP细胞株；提取RNA，并反转录成cDNA，以合成的cDNA为模板，运用实时定量PCR技术对EGFP基因表达进行检测，说明LF化合物是Osx的激活剂；S6、下一步核实LF对Osx的激活作用：C2C12间充质干细胞在DMEM细胞培养液，在37℃、95％饱和湿度的湿化空气中培养，将细胞置于6孔板中，培养至60％
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80％饱和时，用L...

【专利技术属性】
技术研发人员：张驰，
申请(专利权)人：北京大学国际医院，
类型：发明
国别省市：