一种生牛乳中乳铁蛋白的分离制备方法技术

本发明专利技术涉及乳铁蛋白分离领域，公开一种生牛乳中乳铁蛋白的分离方法，包括如下步骤：新鲜的生牛乳加热后通过离心机分离除去脂肪；对脱脂乳进行过滤，除去杂质；滤液保温处理后进入PP层析系统，输送到蛋白层析柱中进行层析处理；水、洗脱液和缓冲溶液用滤膜过滤；用氯化钠溶液洗脱除杂，洗脱分离乳过氧化物酶，分离乳铁蛋白，进行目标蛋白洗脱；进行样品脱盐浓缩处理；脱盐浓缩的洗脱液经过蛋白溶液无菌过滤系统进行除菌；液体样品放入低温冷冻干燥设备中进行冷冻干燥。本发明专利技术解决了现有技术中生牛乳中乳铁蛋白的分离的纯度低，分离出的蛋白的活性低的问题。活性低的问题。活性低的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种生牛乳中乳铁蛋白的分离制备方法


[0001]本专利技术属于乳铁蛋白分离领域，具体涉及一种生牛乳中乳铁蛋白的分离制备方法。

技术介绍

[0002]乳铁蛋白具有广泛的生物学活性，如广谱抗菌性、促进铁的传递、抗炎症、促进细胞增殖和免疫调节等。目前被广泛应用到婴幼儿奶粉、饮料、护肤品和动物饲料当中。上世纪60年代，人们就开始通过研究各种方法来提取乳铁蛋白。根据实验室小试提取乳铁蛋白的纯度、回收率以及加工工艺、生产成本等诸多方面因素来确定产业化生产工艺和技术参数。长久以来，乳铁蛋白的原料来自美国、荷兰、澳大利亚，新西兰等乳制品制造大国。由于乳铁蛋白的产业化生产原料以及加工工艺的不同，致各国产品的纯度存在很大的差别。荷兰DMV公司，是欧洲销量最大的乳铁蛋白供应商，目前全球绝大部分乳粉生产企业所添加的乳铁蛋白都由其供应，其产品目标蛋白纯度可达到95％以上。我国乳铁蛋白产业化技术尚处于空白的阶段，主要原因为副产物如何利用、其他乳成分产业化分离技术不成熟、原料奶供给不足且价格较贵以及标准法规等多方面问题的限制。随着我国奶源的丰富、法律法规的完善、技术的发展、人们对健康以及国际形势认识的提升，未来我国乳铁蛋白产业化分离技术势在必行。
[0003]乳铁蛋白在鲜牛乳中的含量为约为0.1mg/mL，牛初乳中含量最高，一般为0.8
‑
1g/L，而在母乳中其含量高于牛初乳，达到了其含量的1
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3倍。乳铁蛋白分子量约为80KD，是热不稳定蛋白，在60摄氏度以上加热，会导致其活性受到不同程度的损失。新鲜的生牛乳PH为6.6，乳铁蛋白等电点为7.8
‑
8.2，因此，其在牛乳中带正电，其较高的正电性使之易于同酸性特征的组分结合，且乳过氧化物酶的分子量和等电点都与其类似，因此，较难于分离制备纯度高，回收率高且活性高的目标蛋白。据研究，分离制备方法有超滤膜过滤法、电渗析法、离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水性相互作用色谱和凝胶过滤色谱以及膜和层析技术结合等分离技术。但亲和色谱等方法成本高，产率、纯度以及回收率低，无法实现产业化生。离子交换色谱法结合膜脱盐浓缩是分离纯化活性蛋白最有效、应用最广泛的方法之一。

技术实现思路

[0004]本专利技术解决的技术问题是现有技术中生牛乳中乳铁蛋白的分离的纯度低，分离出的蛋白的活性低的问题。
[0005]本专利技术采用的具体方案为：一种生牛乳中乳铁蛋白的分离制备方法，所述分离制备方法包括如下步骤：
[0006](1)生牛乳的预处理：新鲜的生牛乳加热后通过离心机分离除去脂肪；
[0007](2)脱脂乳过滤：对脱脂乳进行过滤，除去杂质；
[0008](3)上样：所述步骤(2)中滤液保温处理后进入PP层析系统，输送到蛋白层析柱中进行层析处理；
[0009](4)缓冲溶液过滤：水、洗脱液和缓冲溶液用滤膜过滤；
[0010](5)洗脱：用氯化钠溶液洗脱除杂，洗脱分离乳过氧化物酶，分离乳铁蛋白，进行目标蛋白洗脱；
[0011](6)脱盐浓缩：进行样品脱盐浓缩处理；
[0012](7)微滤除菌：脱盐浓缩的洗脱液经过蛋白溶液无菌过滤系统进行除菌；
[0013](8)冷冻干燥：所述步骤(7)液体样品放入低温冷冻干燥设备中进行冷冻干燥。
[0014]所述步骤(1)中生牛乳的温度为45
‑
55℃。
[0015]所述步骤(1)分离过程中的离心转速11000rpm。
[0016]所述步骤(8)中冷冻干燥的冻干温度为
‑
50℃～40℃。
[0017]所述冷冻干燥的过程分为两个过程，第一阶段为预冻阶段，温度从室温降到
‑
50℃，真空升华至第二阶段，第二阶段的温度从
‑
50℃升温至40℃，二个阶段的冻干的总时长为48小时。
[0018]所述步骤(7)微滤除菌采用蛋白溶液无菌过滤系统，0.22um孔径PES膜进行除菌。
[0019]所述步骤(6)脱盐浓缩采用的是全自动蛋白超滤系统，PES滤膜平板超滤膜进行样品脱盐浓缩。
[0020]所述步骤(5)中洗脱过程中用0.1mol/L氯化钠溶液洗脱除杂，用0.5mol/L氯化钠溶液洗脱分离乳过氧化物酶，用1.1mol/L的氯化钠分离乳铁蛋白，进行目标蛋白洗脱，洗脱流速为100
‑
200cm/h。
[0021]所述步骤(4)缓冲溶液洗脱液和缓冲溶液用10英寸0.45微米孔径PES滤膜过滤。
[0022]所述步骤(3)中滤液在室温进入层析系统，系统压力设置为0.5MPa，用二级以上纯化水平衡层析柱，设置线性流速600cm/h，PB缓冲溶液加入氯化钠分别配成pH为7的0.4、1.0mol/L洗脱液用PES滤膜过滤后对吸附的碱性蛋白进行洗脱，洗脱流速为200cm/h。本专利技术具有以下有益效果：
[0023]本专利技术生鲜牛乳为原料，以层析分离和膜浓缩工艺分离制备乳铁蛋白，脱脂乳在室温下进样，采用缓冲溶液浓度低速洗乳铁蛋白去除杂质，获得的乳铁蛋白纯度达到95％以上，收率达75％以上。
附图说明
[0024]图1是本专利技术中乳铁蛋白标准曲线；
[0025]图2是本专利技术中温度对目标蛋白标准溶液吸附率的影响图；
[0026]图3是本专利技术中上样流速对目标蛋白吸附率的影响图；
[0027]图4是本专利技术中上样流速对系统压力的影响图；
[0028]图5是本专利技术中LF标准溶液梯度洗脱图；
[0029]图6是本专利技术中LP标准溶液梯度洗脱图；
[0030]图7是本专利技术中LP和LF混合标准溶液梯度洗脱图；
[0031]图8是本专利技术中脱脂乳的梯度洗脱图；
[0032]图9是本专利技术中脱脂乳梯度洗脱凝胶电泳结果图；
[0033]图10是本专利技术中洗脱盐浓度极差分析图；
[0034]图11是本专利技术中洗脱流速极差分析图；
[0035]图12是本专利技术中洗脱液pH极差分析图；
[0036]图13是本专利技术中乳铁蛋白分离制备曲线；
[0037]图14是本专利技术中流穿液和接收峰SDS
‑
PAGE凝胶电泳图；
[0038]图15是本专利技术中乳铁蛋白高效液相色谱检测结果图。
具体实施方式
[0039]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图中示出的具体实施例来描述本专利技术。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本专利技术的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本专利技术的概念。
[0040]本专利技术公开一种生牛乳中乳铁蛋白的分离制备方法，所述分离制备方法包括如下步骤：(1)生牛乳的预处理：新鲜的生牛乳加热后通过离心机分离除去脂肪；(2)脱脂乳过滤：对脱脂乳进行过滤，除去杂质；(3)上样：所述步骤(2)中滤液保温处理后进入PP层析系统，输送到蛋白层析柱中进行层析处理；(4)缓冲溶液过滤：水、洗脱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生牛乳中乳铁蛋白的分离制备方法，其特征在于，所述分离制备方法包括如下步骤：(1)生牛乳的预处理：新鲜的生牛乳加热后通过离心机分离除去脂肪；(2)脱脂乳过滤：对脱脂乳进行过滤，除去杂质；(3)上样：所述步骤(2)中滤液保温处理后进入PP层析系统，输送到蛋白层析柱中进行层析处理；(4)缓冲溶液过滤：水、洗脱液和缓冲溶液用滤膜过滤；(5)洗脱：用氯化钠溶液洗脱除杂，洗脱分离乳过氧化物酶，分离乳铁蛋白，进行目标蛋白洗脱；(6)脱盐浓缩：进行样品脱盐浓缩处理；(7)微滤除菌：脱盐浓缩的洗脱液经过蛋白溶液无菌过滤系统进行除菌；(8)冷冻干燥：所述步骤(7)液体样品放入低温冷冻干燥设备中进行冷冻干燥。2.根据权利要求1所述的生牛乳中乳铁蛋白的分离制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中生牛乳的温度为45
‑
55℃。3.根据权利要求1所述的生牛乳中乳铁蛋白的分离制备方法，其特征在于，所述步骤(1)分离过程中的离心转速11000rpm。4.根据权利要求1所述的生牛乳中乳铁蛋白的分离制备方法，其特征在于，所述步骤(8)中冷冻干燥的冻干温度为
‑
50℃～40℃。5.根据权利要求4所述的生牛乳中乳铁蛋白的分离制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的过程分为两个过程，第一阶段为预冻阶段，温度从室温降到
‑
50℃，真空升华至第二阶段，第二阶段的温度从
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【专利技术属性】
技术研发人员：李春梅，刘永智，张穗生，卢福燊，梁晓琳，谭旑宁，
申请(专利权)人：广西职业技术学院，
类型：发明
国别省市：