一种抗菌肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体的，本发明专利技术公开了一种抗菌肽LFcinB

【技术实现步骤摘要】
一种抗菌肽及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体的，本专利技术公开了一种新型抗菌肽LFcinB
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W及其表达和应用。

技术介绍

[0002]抗生素滥用导致的细菌耐药性已成为全球范围内严重的生态问题，寻找有效的抗生素替代品迫在眉睫。抗菌肽有望替代抗生素成为一种安全、绿色、高效的理想抗菌剂。目前抗菌肽的生产方式主要有三种：天然提取、化学合成和生物工程发酵。天然提取过程甚为复杂且效率低，无法推广应用；化学合成成本高昂，不适合工业化生产；生物工程发酵是采用现代工程技术手段，利用微生物的特定功能，为人类生产产品的一种技术，具备质量稳定、成本低等优势，是实现抗菌肽规模化生产的最佳途径。
[0003]乳铁蛋白肽（LFcinB，FKCRR WQWRM KKLGA PSITC VRRAF）是由牛乳铁蛋白（Bovine Lactoferrin，BLF）经消化酶水解产生的一类具有广谱抑菌活性的两亲性阳离子短肽，具有杀菌快速、不易产生抗药性、热稳定性及水溶性好等优点。目前LFcinB的研究主要集中在探究其生物学活性方面，如何得到高质高量的LFcinB产品是制约其开发应用的关键问题。研究者利用大肠杆菌原核表达系统、动物乳腺表达系统、毕赤酵母表达系统成功地对LFcinB进行了体外表达。CN201510686691.X公开了根据牛乳铁蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列制备表达载体pPIC9K
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LfcinB，并将载体转化到毕赤酵母GS115宿主细胞，形成可表达的重组细胞；培养宿主细胞，使其表达LfcinB抗菌肽；分离浓缩母液，加入蛋白抑制剂及保护剂，经透析和20%的三羟甲基甘氨酸—十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳来获得纯度较高的牛乳铁蛋白；CN201010133179.X公开了利用牛乳铁蛋白的核苷酸序列构建载体pGHX
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LCB，构建重组表达质粒pGEX
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4T
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LCB，将重组质粒转化感受态细胞DH5a，提取被转化的阳性感受态细胞DH5a的质粒转化E.coli BL21，利用大肠杆菌诱导表达乳铁蛋白。但是在大肠杆菌中表达的LFcinB因为缺乏结构修饰多以包含体的形式表达，无法分离纯化；动物乳腺表达系统操作繁琐、周期长、成本高；而在酵母中的表达研究较少，产物产量低、稳定性差、活性低。

技术实现思路

[0004]要解决的问题目前乳铁蛋白肽的抗菌活性有待进一步提高，如何通过基因工程手段提升母肽的抗菌活性，将对抗菌肽的品质进一步的提高，对于本领域技术人员而言是一个重要的挑战。因此，本专利技术的目的是开发一种高抗菌活性的新型抗菌肽，解决现有技术中存在的不足，提供一种新型牛乳铁蛋白衍生肽及其表达和应用。
[0005]技术方案本专利技术利用通过基因工程手段，构建了毕赤酵母表达系统分泌性表达出高抗菌活性的抗菌肽LFcinB
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W，为开发高产、高效并且作用机制明确的新型抗菌肽提供理论依据，对
将来人类的卫生健康和畜牧行业的稳定发展具有重要的应用指导意义。具体的，本专利技术的提供了一种抗菌肽LFcinB
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W，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。SEQ ID No.1：WKWRR WQWRW KKLGA PSITC VRRAF。
[0006]本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种抗菌肽LFcinB
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W， 所述抗菌肽的核苷酸酸序列如SEQ ID No.2所示。SEQ ID No.2：aattctttaaatgtagaagatggcaatggagaatgaaaaaattgggtgctccatctattacttgtgttagaagagctttttaagc。
[0007]本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体中含有如SEQ ID No.2所示序列。重组表达载体是通过分子生物学手段构建的一种适合于蛋白表达的基因载体，对于不同的宿主，表达载体的类型有所不同，分为真核表达载体、原核表达载体、昆虫表达载体等，例如适用于哺乳动物细胞中表达的载体、适用于大肠杆菌中表达的载体、适用于酵母中表达的载体、昆虫表达载体。作为优选，本专利技术的载体为pPIC9K，通过基因工程手段将LFcinB
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W基因序列与pPIC9K载体连接，构建重组表达载体pPIC9K
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LFcinB
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W，导入酵母菌中进行表达获得本专利技术的LFcinB
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W。
[0008]本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种宿主细胞/菌株，所述宿主细胞/菌株含有重组表达载体，所述重组表达载体中含有如SEQ ID No.2所示序列。所述宿主可以是动物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌、酵母菌。作为优选，本专利技术的宿主细胞为动物乳腺细胞，宿主细菌来源为大肠杆菌、毕赤酵母菌，更优选，所述本专利技术的宿主细菌为毕赤酵母GS115菌株。
[0009]本专利技术的一个方面，基于本专利技术的LFcinB
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W高效广谱的抗菌能力，本专利技术的抗菌肽LFcinB
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W可以用于制备药物。任意的与感染相关疾病都是本专利技术LFcinB
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W的潜在的治疗对象，优选的，所述药物可以用于抗菌、抗炎、抗肿瘤，调节肠道菌群。
[0010]本专利技术的一个方面，本专利技术的抗菌肽LFcinB
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W可以用于制备添加剂，所述添加剂为食品、保健品、化妆品或饲料添加剂中的任意一种。本专利技术的LFcinB
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W高效广谱的抗菌能力，本专利技术的LFcinB
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W可以作为一种高效的、绿色、安全的添加剂用于食品保鲜、保健品、化妆品、饲料防腐中，代替各种化学类的防腐剂。
[0011]本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种制备抗菌肽LFcinB
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W的方法，所述方法包括如下步骤：（1）构建重组表达载体，所述重组表达载体含有如SEQ ID No.2所示序列；（2）宿主细胞/细菌活化；（3）将重组表达载体转化宿主细胞/细菌，制备LFcinB
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W表达系统；（4）诱导LFcinB
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W表达系统表达LFcinB
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W。
[0012]本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种制备抗菌肽LFcinB
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W的方法，所述方法包括如下步骤：（1）以SEQ ID No.2为模板克隆LFcinB
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W的基因序列；（2）构建分泌性重组表达载体pPIC9K
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LFcinB
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W；（3）制备毕赤酵母感受态细胞GS115；（4）重组表达载体电转化至GS115感受态细胞，并通过MD培养基和MM培养基筛选及PCR鉴定，筛选高拷贝转化子的新型抗菌肽LFcinB
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W重组毕赤酵母GS115菌株；（5）使用甲醇诱导LFcinB
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W重组毕赤酵母GS115菌株进行发酵，分泌性表达出抗菌肽LFcinB<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽LFcinB
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W，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种抗菌肽LFcinB
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W，其特征在于，所述抗菌肽的核苷酸酸序列如SEQ ID No.2所示。3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含有如SEQ ID No.2所示序列。4.一种宿主细胞/菌株，其特征在于，所述宿主细胞/菌株含有重组表达载体，所述重组表达载体中含有如SEQ ID No.2所示序列。5.根据权利要求4所述宿主菌株，其特征在于，所述菌株为毕赤酵母GS115菌株。6.根据权利要求4所述宿主菌株，其特征在于，所述重组表达载体为pPIC9K
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LFcinB
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W。7.根据权利要求1所述抗菌肽LFcinB
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【专利技术属性】
技术研发人员：肖桂然，闫永平，纪晓雯，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：