基于新型黄色荧光的免疫层析试纸条及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种基于新型黄色荧光的免疫层析试纸条，该试纸条以新型黄色荧光CD@SiO2纳米球为信号物，消除背景蓝色荧光的干扰；该试纸条以黄色荧光CD@SiO2纳米球

【技术实现步骤摘要】
基于新型黄色荧光的免疫层析试纸条及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及CA125和HE4检测领域，尤其涉及一种新型黄色荧光CD@SiO2纳米球的免疫层析试纸条制备及其对双组分CA125、HE4的检测，黄色荧光CD@SiO2纳米球
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CA125抗体缀合物和黄色荧光CD@SiO2纳米球
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HE4抗体缀合物及其制备方法，以及试纸条上双组分检测的应用。

技术介绍

[0002]免疫层析试纸条由于其即时检测，方法简单，检测时间段，成本低等优点而成为倍受青睐的检测手段。随着免疫层析技术的发展，越来越多的物质被用作试纸条的信号物，以提高足够的灵敏度。在信号物中，从比色信号物(例如Au、碳材料和染料)发展为非比色信号物(例如荧光染料、量子点QD、上转换磷光体、磁性和表面增强拉曼散射SERS粒子)，从较小的纳米信号物发展为其不同的形态(如纳米棒、纳米壳和纳米立方体)或二级结构(如多聚体金信号物、荧光纳米球、磁性纳米球)。
[0003]荧光纳米球一般是指球体表面标有荧光材料(包括表面覆盖)或球体内部结构含有荧光材料(如嵌入或聚合)，可以通过外部能量激发荧光。荧光染料、上转换荧光材料和半导体是常用的荧光材料。这些纳米珠的制备通常效率低下、耗时、昂贵或需要使用危险化学品。
[0004]针对CA125和HE4检测，开发一种简单、快捷、无毒、低成本的荧光免疫层析试纸条，成为本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：针对现有技术的不足与缺陷，本专利技术提供一种基于新型黄色荧光的免疫层析试纸条及其制备方法与应用，具有简单、快捷、无毒、低成本等优点。
[0006]技术方案：本专利技术的基于新型黄色荧光的免疫层析试纸条，其特征在于：该试纸条以新型黄色荧光CD@SiO2纳米球为信号物，消除背景蓝色荧光的干扰；该试纸条以黄色荧光CD@SiO2纳米球
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CA125抗体缀合物，黄色荧光CD@SiO2纳米球
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HE4抗体缀合物，为以CA125、HE4为抗原的黄色荧光CD@SiO2纳米球标记的荧光免疫层析试纸条结构；该试纸条为以黄色荧光CD@SiO2纳米球为信号物的三明治型夹心免疫传感器，形成对CA125、HE4双组分的联合检测。
[0007]基于新型黄色荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：
[0008]1)制备硅烷化CDs；
[0009]2)制备黄色荧光CD@SiO2纳米球；
[0010]3)制备黄色荧光CD@SiO2纳米球
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CA125抗体缀合物和CD@SiO2纳米球
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HE4抗体缀合物；
[0011]4)构建肿瘤标志物CA125、HE4双组分免疫检测体系，获得试纸条。
[0012]其中，步骤1)中制备硅烷化CDs时，将虎红RB溶于水中，加入3
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氨基丙基三甲氧基
硅烷APTMS，在反应釜中高温水热反应形成硅烷化CDs溶液，高速离心弃去离心管底部大颗粒后进行透析，获得硅烷化CDs。
[0013]具体的，6mg/ml～10mg/ml的虎红溶解在水中，加入1～1.5mL的3
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氨基丙基三甲氧基硅烷，转移至水热反应釜中，200℃
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10℃，反应6～8h。随后离心，除去底部大颗粒，随会进行透析纯化。
[0014]其中，步骤2)中制备黄色荧光CD@SiO2纳米球时，包括下述步骤；硅烷化黄色荧光碳点的制备；树枝状二氧化硅球体制备；树枝状二氧化硅球体连接硅烷化黄色荧光碳点。添加浓度为4mg/ml～40mg/ml的十六烷基溴化胺和浓度为0.4mg/ml～20mg/ml的水杨酸钠，0.04mg/ml～8mg/ml的三乙醇胺添加到水中，在温度80℃
±
5℃下进行搅拌，然后添加正硅酸四乙酯，在温度80℃
±
5℃下搅拌1.5～2.5h后用乙醇稀释并通过离心收集产物，将沉淀物用乙醇洗涤若干次，将沉淀物分散在HCl/乙醇混合物中，并在温度60℃
±
5℃下进行搅拌12～24h，提取残留的有机模板，重复萃取后获得树状二氧化硅纳米球。
[0015]具体的，步骤2)中制备黄色荧光CD@SiO2纳米球时，使用的CTAB终浓度为0.02mg/ml～20mg/ml，TEOS终浓度为0.01％～12％，水杨酸钠终浓度为0.02mg/ml～10mg/ml，TEA终浓度0.007mg/ml～0.7mg/ml；将离心收集沉淀物分散在HCl和乙醇的混合液中，搅拌以萃取残余物有机模板，重复萃取后将产物洗涤至中性。
[0016]具体的，步骤2)中制备黄色荧光CD@SiO2纳米球时，将硅烷化CDs分散于乙醇中，加入洗涤至中性的SiO2，常温避光震荡6
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12h后用无水乙醇洗涤至上清液澄清透明，去除多余未负载的硅烷化碳点，获得黄色荧光CD@SiO2纳米球。
[0017]其中，步骤3)中将步骤2)制得的新型黄色荧光CD@SiO2纳米球标记的CA125标记抗体与含有CA125抗原的PBS缓冲液于室温下孵育1min～30min，CA125与标记抗体形成免疫复合物，将混合液滴加在步骤1)制得的免疫层析试纸条的样品垫上，在毛细管作用力下，免疫复合物迁移至T1线，余下的新型黄色荧光CD@SiO2纳米球标记的CA125标记抗体迁移至C线；新型黄色荧光CD@SiO2纳米球标记的HE4标记抗体与含有HE4抗原的PBS缓冲液于室温下孵育1min～30min，HE4与标记抗体形成免疫复合物，将混合液滴加在步骤1)制得的免疫层析试纸条的样品垫上，在毛细管作用力下，免疫复合物迁移至T2线，余下的新型黄色荧光CD@SiO2纳米球标记的HE4标记抗体迁移至C线在紫外灯下观察得到CA125、HE4的荧光免疫层析试纸条传感器的T1、T2线和C线。
[0018]具体的，步骤3)中黄色荧光CD@SiO2纳米球用APTES先进行氨基化，后将丁二酸苷与氨基封端的黄色荧光CD@SiO2纳米球反应将其羧基化，再利用EDC/NHS将黄色荧光CD@SiO2纳米球表面的羧基活化；分别加入CA125、HE4抗体，室温孵育获得黄色荧光CD@SiO2纳米球
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CA125抗体缀合物和黄色荧光CD@SiO2纳米球
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HE4抗体缀合物。
[0019]该试纸条包括将黄色荧光CD@SiO2纳米球抗体缀合物与CA125、HE4通过抗原
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抗体之间的相互作用制备的荧光信号标记物；该试纸条包括依次粘连在黑色底板上的样品垫、包被有检测T1、T2线和对照C线的硝基纤维素膜和吸水垫；所述硝基纤维素膜T1线上包被有CA125抗体，T2线上包被有HE4抗体；所述硝基纤维素膜C线上包被有羊抗鼠多克隆抗体。
[0020]所述的T1线的CA125抗体的浓度为0.04～0.07mg/cm2，T2线HE4抗体的浓度为0.04～0.07mg/cm2所述C线的羊抗鼠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于新型黄色荧光的免疫层析试纸条，其特征在于：该试纸条以新型黄色荧光CD@SiO2纳米球为信号物，消除背景蓝色荧光的干扰；该试纸条以黄色荧光CD@SiO2纳米球
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CA125抗体缀合物，黄色荧光CD@SiO2纳米球
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HE4抗体缀合物，为以CA125、HE4为抗原的黄色荧光CD@SiO2纳米球标记的荧光免疫层析试纸条结构；该试纸条为以黄色荧光CD@SiO2纳米球为信号物的三明治型夹心免疫传感器，形成对CA125、HE4双组分的联合检测。2.基于新型黄色荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：1)制备硅烷化CDs；2)制备黄色荧光CD@SiO2纳米球；3)制备黄色荧光CD@SiO2纳米球
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CA125抗体缀合物和CD@SiO2纳米球
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HE4抗体缀合物；4)构建肿瘤标志物CA125、HE4双组分免疫检测体系，获得试纸条。3.根据权利要求2所述的基于新型黄色荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述的步骤1)中制备硅烷化CDs时，将虎红RB溶于水中，加入3
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氨基丙基三甲氧基硅烷APTMS，在反应釜中高温水热反应形成硅烷化CDs溶液，高速离心弃去离心管底部大颗粒后进行透析，获得硅烷化CDs。4.根据权利要求2所述的基于新型黄色荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述的步骤2)中制备黄色荧光CD@SiO2纳米球时，使用的CTAB终浓度为0.02mg/ml～20mg/ml，TEOS终浓度为0.01％～12％，水杨酸钠终浓度为0.02mg/ml～10mg/ml，TEA终浓度0.007mg/ml～0.7mg/ml；将离心收集沉淀物分散在HCl和乙醇的混合液中，搅拌以萃取残余物有机模板，重复萃取后将产物洗涤至中性。5.根据权利要求2所述的基于新型黄色荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述的步骤2)中制备黄色荧光CD@SiO2纳米球时，将硅烷化CDs分散于乙醇中，加入洗涤至中性的SiO2，常温避光震荡后用无水乙醇洗涤至上清液澄清透明，获得黄色荧光CD@SiO2纳米球。6.根据权利要求2所述的基于新型黄色荧光的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁收年，王紫璇，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：