一种多抗夹心模式的免疫层析试纸条及其用途制造技术

一种多抗夹心模式的免疫层析试纸条及其用途，属于免疫层析检测领域。该试纸条包含样品垫、结合垫、吸水垫、硝酸纤维素(NC)膜、PVC底板、检测线(T线)、质控线(C线)；原核表达制备多价单域重链抗体3

【技术实现步骤摘要】
一种多抗夹心模式的免疫层析试纸条及其用途


[0001]本专利技术涉及免疫层析检测领域，具体涉及一种多抗夹心模式的免疫层析试纸条及其用途。
技术背景
[0002]新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)可引起新型冠状肺炎、肠道等疾病，具有极强的致病性与传播性，对各国的人民健康、财产安全、政治经济都造成了巨大的威胁。此外，新冠病毒一直处于变异中，如Alpha、Beta、Gamma、Delta、 Lambda和Omicron等，新冠的传播与致死能力得到进一步的进化，但目前并无针对新冠病毒的特效药物，及早遏制其传播是至关重要的。
[0003]新型冠状病毒由RNA及结构蛋白(刺突蛋白、膜蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白)组成，根据检测的靶标不同，分为核酸检测法和免疫分析法。在核酸检测法中，实时荧光RT
‑
PCR法检测通量大、灵敏度高、结果较为准确，是检测新型冠状病毒的金标准。但该方法检测时间长、需要专业的操作人员与设备、样本难以保存、RNA模板质量要求高，在新冠病毒的大规模筛查具有较大的局限性。免疫层析试纸条法检测速度快、操作简单、检测效率高、可适用于多个检测场景，是核酸检测的重要补充，如专利“一种新型冠状病毒抗原检测试纸条
”ꢀ
(授权号CN112557654B)，提供了一种基于双单抗夹心法检测新冠病毒抗原的试纸条。但单克隆抗体及配对单抗的制备周期长、步骤繁琐、操作难度大、批间差异大，对检测体系稳定性、精确性有着较大的影响，一种成本低廉、制备简单、性能稳定的抗原识别元件及抗体配对模式仍有待开发。
[0004]市面销售的新冠抗原检测试剂盒多数以胶体金为检测信号，其检测灵敏度低，而荧光材料具有检出背景值低、灵敏高等优点，是优良的检测信号。如专利“一种快速检测新型冠状病毒抗原的量子点荧光免疫层析试纸条”(申请号： 202010749168.8)，提供了一种基于荧光量子点的新冠检测试纸条，相比胶体金方法，检测灵敏度提升了数倍，但与RT
‑
PCR相比，检测灵敏度仍有待进一步提升。荧光能量共振转移是指一个供体基团和一个受体基团光谱有一定重叠，当供体基团与受体基团因为某种原因靠近时(1
‑
10nm)，供体分子的能量转移至受体，散发出荧光量子产率极高的荧光，能够有效的提高检测体系的灵敏度。

技术实现思路

[0005]本专利技术基于检测性能稳定、制备程序简单的重链单域抗体，开发了一种多抗夹心的配对抗体模式，并进一步制备成本低、批间差异小、检测灵敏度高的免疫层析试纸条，应用于新型冠状病毒大规模的筛查。免疫试纸条包含样品垫、结合垫、吸水垫、硝酸纤维素(NC)膜、试纸条(PVC)底板；制备了单域重链抗体3
×
A、3
×
B、3
×
C作为核心检测元件，抗组氨酸(His)标签单克隆抗体划线于质控线(C线)，3
×
B/3
×
C标记偶联荧光染料并滴加于结合垫，单域重链抗体3
×
A标记荧光微球并划线于检测线(T线)；当抗原存在时，荧光染料
‑3×
A与荧光微球
‑3×
B、荧光微球
‑3×
C通过抗原形成复合物，产生荧光信号，若无抗原存在，
则无信号产生。具体方案如下：
[0006](1)按照大肠杆菌表达体系，优化纳米抗体表达基因的密码子并合成，通过酶切位点将基因接入pET系列表达载体，构建了原核表达载体；将表达载体导入大肠杆菌，0.1
‑
0.5mM异丙基－β－D－硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白，镍离子(Ni
+
)重力柱吸附目的蛋白，使用不同浓度的咪唑优化纳米抗体洗脱浓度，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
‑
PAGE)、酶连免疫吸附实验(ELISA)分析纯化纳米材料的生物学性能；筛选获取一组检测性能优异的多抗对
‑
单域重链抗体A、重链单域抗体B、重链单域抗体C，为进一步提高灵敏度，构建了多价单域重链抗体3
×
A、3
×
B、3
×
C。
[0007](2)取一定量的荧光染料和荧光微球溶解于至2
‑
(N
‑
吗啡啉)乙磺酸 (MES)溶液中，使用2
‑
10μL 1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)/N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化微球/染料表面的羧基；分别投入40
‑ꢀ
120μg的单域重链抗体3
×
A、3
×
B、3
×
C，使得3
×
A和3
×
B、3
×
C分别偶联至荧光微球和荧光染料的表面，制备靶向新冠N蛋白的纳米探针；1
‑
3％牛血清白蛋白(BSA)封闭多余位点，保存液重悬制备的纳米探针，4℃保存。
[0008](3)使用在真空干燥箱内，干燥NC膜；NC膜、吸水垫、结合垫以及样品垫，按照试纸条结构原理，分别组装粘贴至底板上，样品垫在结合垫上约压2
ꢀ‑
4mm；使用喷金划膜仪将荧光微球
‑
单域重链抗体3
×
A、抗His单克隆抗体划线于NC膜上作为试纸条的检测线和质控线，37℃干燥1
‑
2h。按照试纸条的规格，用试纸条切割机切割成试纸条；将2
‑
10μL荧光染料
‑3×
B和荧光染料
‑3ꢀ×
C复合物滴加于结合垫上，37℃干燥1
‑
2h；稀释新冠N蛋白至0
‑
10ng/mL，各取滴加于样品垫，10min后读取结果，评估试纸条的检测灵敏度。
[0009]优选步骤1)：上述步骤(1)中pET系列载体为pET22、pET25、pET28或 pET30。
[0010]优选步骤2)：上述步骤(1)中洗脱的最佳咪唑浓度为100
‑
500mM；使用缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)，最佳浓度为0.01
‑
0.1mM。
[0011]优选步骤3)：上述步骤(2)中MES缓冲液的最佳pH为4
‑
6，最佳浓度 5
‑
30mg/mL。
[0012]优选步骤4)：上述步骤(3)中，试纸条的最佳规格为4
‑6×
40
‑
80mm；稀释新冠N蛋白的缓冲液为PBST，最佳浓度为0.01
‑
0.05％；滴加样点垫上的最佳样品体积为50
‑
150μL；划线于质控线的抗His单克隆抗体的浓度为0.1
‑ꢀ
1.5mg/mL。
[0013]本专利技术有益效本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种病毒抗原的检测方法，其特征在于：通过多抗夹心法检测实现，该多抗夹心法使用了至少三种多价单域重链抗体做为检测元件进行多抗夹心检测。2.根据权利要求1所述的病毒抗原的检测方法，其特征在于：所述的方法应用于新型冠状病毒核衣壳蛋白的检测，或适用新型冠状病毒核衣壳蛋白以外的大分子蛋白的检测或新冠检测平台。3.多价单域重链抗体，其特征在于：所述的多价单域重链抗体3
×
A、3
×
B、3
×
C的序列分别为：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，所述的多价单域重链抗体3
×
A、3
×
B、3
×
C用于权利要求1或2所述的多抗夹心检测。4.权利要求3所述的多价单域重链抗体的制备方法，其特征在于，多价单域重链抗体3
×
A、3
×
B、3
×
C通过以下方法得到：1)按大肠杆菌密码子偏好性，优化单域重链抗体3
×
A、3
×
B、3
×
C的表达基因密码子，合成表达基因并克隆至pET载体中，构建表达载体；2)使用氯化钙制备BL21(DE3)的感受态细胞，将含有目的基因的表达载体通过化学转化法的转入BL21感受态；挑取LB/Amp平板转化成功的单菌落，接种3
‑
7mL LB液体培养基37℃过夜培养；3)按照1
‑
3％接种于40
‑
60mL LB/Amp试管培养基，菌体生长至对数生长期，加入0.1
‑
0.5mM IPTG，18℃培养12
‑
16h；将菌液转移至离心管，收集菌体沉淀重悬于PBS缓冲液中，超声破碎菌体；4)破碎液经Ni
‑
NAT重力柱纯化，超滤除去纯化蛋白中的氨基基团，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定超滤后蛋白浓度，SDS
‑
PAGE、ELISA鉴定超滤后蛋白的纯度及生物学性能。5.一种实现权利要求1或2所述方法的多抗夹心模式的免疫层析试纸条，其特征在于，试纸条包含样品垫、结合垫、吸水垫、硝酸纤维素(NC)膜、PVC底板、检测线(T线)、质控线(C线)组成，单域重链抗体3
×
A标记荧光染料划线于T线，抗His标签单克隆抗体划线于NC膜作为C线，单域重链抗体3
×
B/3
×
C标记偶联荧光微球滴加于结合垫。6.根据权利要求5所述的多抗夹心模式的免疫层析试纸条，其特征在于，试纸条的规格为4
‑6×
40
‑
80mm；所测样本为唾液、鼻涕中的新型冠状病毒核衣壳蛋白。7.权利要求5或6所述的多抗夹心模式的免疫层析试纸条用于检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：1)优化单域重链抗体，表达基因的密码子并合成，接入pET系列表达载体，构建了表达载体，导入大肠杆菌，0.1
‑
0.5mM IPTG诱导表达目的蛋白，Ni重力柱纯化目的蛋白，使用不同浓度的咪唑优化纳米抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗义，胡文进，毛大庆，袁青彬，蔺怀，刘奕辰，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：