一种贴壁细胞快速无血清悬浮驯化方法及驯化悬浮细胞技术

本发明专利技术提出了一种贴壁细胞快速无血清悬浮驯化方法及驯化悬浮细胞，属于悬浮驯化技术领域。先采用第一无血清培养基对贴壁细胞进行培养并传代，再采用第二无血清培养基继续进行培养并传代，直至贴壁细胞的比生长速率大于0.3/天，并且细胞活率为90

【技术实现步骤摘要】
一种贴壁细胞快速无血清悬浮驯化方法及驯化悬浮细胞


[0001]本专利技术涉及悬浮驯化
，具体涉及一种贴壁细胞快速无血清悬浮驯化方法及驯化悬浮细胞。

技术介绍

[0002]目前贴壁细胞如HEK293细胞的培养方式多采用带血清的培养基进行培养，血清存在来源复杂，价格昂贵，成分复杂，易污染等缺点，对产物的纯化与使用不利。通常的无血清细胞驯化培养有两种，一、直接使用无血清培养基培养，细胞结团率高，细胞传代过程中细胞活率持续降低；二、采用逐步减少血清的驯化方法，此方法耗时长，操作复杂，驯化完成的细胞只会适应其驯化时采用的培养基，商业生产受限；所以需要一种操作简单时间短，培养基适应性强的驯化方法。
[0003]然而，市售的无血清培养基中含有缓冲体系(缓冲对)，在进行细胞培养时，需要再次添加缓冲溶液。
[0004]HEPES是一种非离子两性缓冲液,其在pH＝7.2
‑
7.4范围内具有较好的缓冲能力。其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值.磷酸缓冲体系中能够提供很好渗透压和磷等微量元素。采用碳酸氢盐，可以解除需要高浓度CO2培养环境的限制，同时溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长也是很重要的，在HEPES缓冲体系中能够很好维持细胞活性，而磷酸缓冲体系细胞能够保持较高VCD。
[0005]但是，复合的缓冲体系会对细胞的生长和增殖造成严重影响。例如，同时使用HEPES和浓度超过0.3g/L高浓度磷酸盐会导致造成渗透压超过细胞最适渗透压，还具有细胞毒性。
专利技术内容
[0006]本专利技术的目的在于提出一种贴壁细胞快速无血清悬浮驯化方法及驯化悬浮细胞，无需在培养过程中进行减血清的操作，具有简单快捷、高质高效的优点，能够适用于市面上绝大多数无血清培养基，在后续的继续培养时，不需要适应期即可实现快速的培养，有效降低了贴壁细胞的成本，使其能够快速商用。
[0007]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0008]本专利技术提供一种贴壁细胞快速无血清悬浮驯化方法，先采用第一无血清培养基对贴壁细胞进行培养并传代，再采用第二无血清培养基继续进行培养并传代，直至贴壁细胞的比生长速率大于0.3/天，并且细胞活率为90
‑
100％，则悬浮驯化培养完成。
[0009]作为本专利技术的进一步改进，所述第一无血清培养基包括培养基基质和第一无血清培养基缓冲体系，所述第一无血清培养基缓冲体系包括浓度为1g/L
‑
4g/L的碳酸氢钠溶液和/或浓度为10
‑
25Mm的HEPES缓冲液；
[0010]所述第二无血清培养基包括培养基基质以及第二无血清培养基缓冲体系，所述第二无血清培养基缓冲体系包括浓度为1g/L
‑
4g/L的碳酸氢钠溶液和/或浓度为100mg/L
‑
500mg/L的磷酸氢二钠溶液。
[0011]作为本专利技术的进一步改进，所述第一无血清培养基缓冲体系包括浓度为1.9g/L的碳酸氢钠溶液和/或浓度为10Mm的HEPES缓冲液；所述第二无血清培养基缓冲体系包括浓度为1.9g/L的碳酸氢钠溶液和/或浓度为130mg/L的磷酸氢二钠溶液；
[0012]所述第一无血清培养基缓冲体系和所述第二无血清培养基缓冲体系均还包括氢氧化钠溶液，并且两者的pH值为7.2。
[0013]作为本专利技术的进一步改进，包括以下步骤：
[0014]S1、将贴壁细胞制备成单细胞悬液；
[0015]S2、将单细胞悬液以1.0
‑
2.0
×
106细胞数/mL的接种密度接种于所述第一无血清培养基，接种后加入细胞保护剂，得到细胞培养液，对所述细胞培养液进行培养；
[0016]S3、培养两天，并且每24h进行一次取样计数；按照1.0
‑
2.0
×
106细胞数/mL的细胞密度传代2
‑
3次并维持细胞数大于80％；
[0017]S4、用细胞筛网过滤去除最后一次传代培养得到的细胞培养液中的细胞团块，过滤后的细胞按照1.0
‑
2.0
×
106细胞数/mL密度接种于所述第二无血清培养基中，继续培养24h；
[0018]S5、取样计数，根据细胞密度进行第一次判断：若活细胞密度不变或降低，采用步骤S501继续培养；若活细胞密度提高，继续培养48h，取样计数，根据细胞密度进行第二次判断：若细胞密度低于或等于2.0
×
106细胞数/mL，采用步骤S501的步骤继续培养，若细胞密度高于2.0
×
106细胞数/mL，直接进行步骤S6；
[0019]所述步骤S501为：将细胞转移至离心管中，于4℃沉降1
‑
3h，吸取去一半体积的上清，添加一半第二无血清培养基再继续培养24h，取样计数，若细胞密度降低，重复将细胞转移至离心管中，于4℃沉降1
‑
3h，吸取去一半体积的上清，添加一半第二无血清培养基再继续培养24h，取样计数，直至细胞密度升高至高于2.0
×
106细胞数/mL，进行步骤S6；
[0020]S6、使用所述第二无血清培养基将细胞稀释至1.0
‑
2.0
×
106细胞数/mL，再进行传代培养，每次传代培养时向细胞悬液中添加细胞保护剂，根据每次传代培养的细胞结团率情况依次减少细胞保护剂的添加量；
[0021]S7、连续传代至细胞的比生长速率μ＞0.34/天，并且细胞活率≥90％，则悬浮驯化培养完成。
[0022]作为本专利技术的进一步改进，步骤S2和S6中，所述细胞保护剂包括浓度为10mg
‑
300mg/L的硫酸葡聚糖溶液和浓度为1
‑
5g/L的聚醚F68。
[0023]作为本专利技术的进一步改进，所述细胞保护剂包括浓度为100mg/L的硫酸葡聚糖溶液和浓度为3g/L的聚醚F68。
[0024]作为本专利技术的进一步改进，步骤S1中，采用汇合度为80％以上的贴壁细胞进行消化传代；终止消化后，制备成所述单细胞悬液。
[0025]作为本专利技术的进一步改进，步骤S501中，具体的培养步骤为，将细胞培养液转移至离心管中，并在4℃下沉降1
‑
3h，沉降后吸去一半体积的上清，并补充相同体积的新鲜的第二无血清培养基，继续培养。
[0026]作为本专利技术的进一步改进，步骤S6中，所述细胞保护剂每次的添加量较上一次减少25％
‑
50％的体积。
[0027]进一步，培养条件是37℃、CO2的体积百分数为5％、湿度大于或等于80％、转速为110
‑
130rpm。
[0028]本专利技术进一步保护一种采用上述的贴壁细胞快速无血清悬浮驯化方法得到的驯化悬浮细胞，所述贴壁细胞为HEK293贴壁细胞。
[0029]本专利技术具有如下有益效果：...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种贴壁细胞快速无血清悬浮驯化方法，其特征在于，先采用第一无血清培养基对贴壁细胞进行培养并传代，再采用第二无血清培养基继续进行培养并传代，直至贴壁细胞的比生长速率大于0.3/天，并且细胞活率为90
‑
100％，则悬浮驯化培养完成。2.根据权利要求1所述一种贴壁细胞快速无血清悬浮驯化方法，其特征在于，所述第一无血清培养基包括培养基基质和第一无血清培养基缓冲体系，所述第一无血清培养基缓冲体系包括浓度为1g/L
‑
4g/L的碳酸氢钠溶液和/或浓度为10
‑
25Mm的HEPES缓冲液；所述第二无血清培养基包括培养基基质以及第二无血清培养基缓冲体系，所述第二无血清培养基缓冲体系包括浓度为1g/L
‑
4g/L的碳酸氢钠溶液和/或浓度为100mg/L
‑
500mg/L的磷酸氢二钠溶液。3.根据权利要求2所述一种贴壁细胞快速无血清悬浮驯化方法，其特征在于，所述第一无血清培养基缓冲体系包括浓度为1.9g/L的碳酸氢钠溶液和/或浓度为10Mm的HEPES缓冲液；所述第二无血清培养基缓冲体系包括浓度为1.9g/L的碳酸氢钠溶液和/或浓度为130mg/L的磷酸氢二钠溶液；所述第一无血清培养基缓冲体系和所述第二无血清培养基缓冲体系均还包括氢氧化钠溶液，并且两者的pH值为7.2。4.根据权利要求1
‑
3任意一项所述一种贴壁细胞快速无血清悬浮驯化方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将贴壁细胞制备成单细胞悬液；S2、将单细胞悬液以1.0
‑
2.0
×
106细胞数/mL的接种密度接种于所述第一无血清培养基，接种后加入细胞保护剂，得到细胞培养液，对所述细胞培养液进行培养；S3、培养两天，并且每24h进行一次取样计数；按照1.0
‑
2.0
×
106细胞数/mL的细胞密度传代2
‑
3次并维持细胞数大于80％；S4、用细胞筛网过滤去除最后一次传代培养得到的细胞培养液中的细胞团块，过滤后的细胞按照1.0
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2.0
×
106细胞数/mL密度接种于所述第二无血清培养基中，继续培养24h；S5、取样计数，根据细胞密度进行第一次判断：若活细胞密度不变或降低，采用步骤S501继续培养；若活细胞密度提高，继续培养48h，取样计数，根据细胞密...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈世民，纪腾，汤杰，韩迎燕，周靖轩，
申请(专利权)人：武汉凯德维斯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：