一种基于MLPA-NGS方法用于司法鉴定的SNP位点检测组合物及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于MLPA

【技术实现步骤摘要】
一种基于MLPA
‑
NGS方法用于司法鉴定的SNP位点检测组合物及其应用


[0001]本专利技术涉及法医遗传学
，尤其涉及一种基于MLPA
‑
NGS方法用于司法鉴定的SNP位点检测组合物及其应用。

技术介绍

[0002]基于毛细管电泳技术(Capillary Electrophoresis，CE)的PCR
‑
STR复合荧光扩增检测是目前进行法医学鉴定的主要技术手段。短串联重复序列(short tandem repeat，STR)又称微卫星DNA(micro satellite DNA)，是一类广泛存在于人类基因组中的DNA多态性基因座。它由2～6碱基对构成核心序列，呈串联重复排列。STR基因位点长度一般在100～300bp之间。因个体间DNA片断长度或DNA序列差异而成高度多态性，在基因传递过程中遵循孟德尔共显性方式遗传，因其基因片段短、扩增效率高、判型基本准确等特点，已广泛应用于法医学个体识别和亲子鉴定等领域。目前，法医学DNA数据库大部分均围绕STR基因座展开。但是STR也存在一定的缺陷，这些缺陷包括：STR基因座的突变率过高，有时给亲权鉴定带来困扰；PCR扩增子较长，在以降解检材为模板的检测中不易扩增；STR基因座的数量有限，难于进行复杂亲缘关系的鉴定；毛细管电泳技术中目前可供选择的荧光基团数量有限，不能实现大量STR基因座的并行检测。
[0003]SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，可由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。与STR(自发突变率为10
‑3～10
‑5)相比，SNP具有相对较低的自发突变率(10
‑8)；如使用PCR方法，单个的SNP位点扩增产物可以控制在200bp以下，有利于降解检材的分型；大量SNP为二等位基因，此特性也使其分型结果的分析简便易行，易于自动化处理。
[0004]在NGS(下一代测序技术)，又称高通量测序技术成熟之前，SNP分型采用的技术平台主要包括：Mini sequencing(核心是单碱基延伸)、质谱分析，但只能完成几十个遗传标记的并行检测，难以满足SNP司法鉴定的数量需要。
[0005]高通量测序技术成熟之后，使用该技术可以对多达几千个SNP进行并行检测，具有：(1)节约检测样本量及检测时间；(2)对多样本并行检测；(3)将引物设计的尽可能短，提高降解检材的分型成功率等多种优点。由于此原因，美国Thermo Fisher Scientific公司在Ion Torrent PGMTM测序平台推出两款商业化SNP检测试剂盒，一是用于个体识别的“Precision ID Identity Panel”，试剂盒中共含有124个SNP位点，主要针对欧洲人群；另一个是用于族源信息分析的“Precision ID Ancestry Panel”，不适合个体识别和亲缘鉴定。美国Illumina公司推出可同时检测STR和SNP遗传标记的检测试剂盒ForenSeq DNA Signature，其中含有95个用于个体识别的SNP位点，24个用于表型鉴定的位点，56个先祖SNP位点。中国司法部司法鉴定科学技术研究所的李成涛、张素华、边英男、刘希玲等人开发
的”一种基于高通量测序的SNP位点的检测试剂盒及其检测方法“，包括了273个SNP位点(234个位于常染色体上、9个位于Y染色体上、30个位于X染色体上)，可进行三联体亲子鉴定、二联体亲子鉴定、祖孙鉴定、同胞鉴定以及个体识别司法鉴定领域中的应用；片段文库集中于200bp以下，适用于法医学降解检材；所选位点面向中国人群，大大完善了SNP司法遗传检测在中国人群中的利用价值。吴良俊于2019年发表的硕士论文“1245个SNPs靶向捕获与高通量测序体系的构建及法医学应用初探”，是一种基于分子倒置探针技术(molecular inversion probe，MIP)的、以SNP为检测对象的高通量测序重SNP检测方法。该技术检测的SNP位点超过1000个，但每次每个样品中所能测出的SNP只有一半多一些，且在各个样本各次检测中变化极大，不适合用于司法鉴定。
[0006]然而，使用超多重PCR对SNP位点进行扩增，进而进行高通量测序的方法，也存在一些缺点：(1)由于扩增体系中包含了大量序列各异的引物，引物与引物之间的非特异扩增难以避免，而降低非特异扩增的引物设计手段极其复杂；降低非特异扩增的引物设计，必然减少对SNP位点选择的灵活性；(2)对SNP所在位点的扩增，产物长度虽可低于200bp但不能过低，对于降解检材检测的优势有限。
[0007]因此，基于上述现有SNP检测存在的各种不足，仍需要开发更多的多重的SNP检测方法。

技术实现思路

[0008]为了克服现有技术中存在的至少一个问题，本专利技术提供一种基于MLPA
‑
NGS方法用于司法鉴定的SNP位点检测组合物及其应用，其设计了一套基于MLPA
‑
NGS方法的、针对中国人群并覆盖人类全基因组的高多态性SNP检测体系，用于满足个体识别及亲权鉴定，为复杂疑难案件的解决提供更多的技术检测手段。与超多重PCR的建库方式相比，MLPA
‑
NGS技术的探针设计基本无需考虑引物之间的非特异扩增，且由于一对探针覆盖50bp左右的模板，其可用于50bp长度左右的降解检材的检测。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0010]本专利技术的第一个方面是提供一种基于MLPA
‑
NGS方法用于司法鉴定的SNP位点检测组合物，其包括SNP探针组合物和引物组合物；所述SNP探针组合物为分别设计于常染色体的66个SNP位点、X染色体的51个SNP位点、Y染色体的25个SNP位点的SNP探针对；所述引物组合物为用于扩增连接后的探针的带有index序列的通用引物，各所述探针对分别包括左侧探针和右侧探针，所述左侧探针的5
’
端和所述右侧探针的3
’
端分别包含一段通用序列，其作为所述通用引物扩增时的结合序列；其中，所述SNP探针对的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.284所示；所述通用引物的序列如SEQ ID NO.285～SEQ ID NO.286所示，左侧探针的5
’
端的通用序列如SEQ ID NO.287所示，右侧探针的3
’
端的通用序列如SEQ ID NO.288所示。具体地，参与反应的探针整体序列为：左侧探针：5
’‑
通用序列
‑
结合模板DNA序列
‑3’
，右侧探针：5
’‑
结合模板DNA序列
‑
通用序列
‑3’
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于MLPA
‑
NGS方法用于司法鉴定的SNP位点检测组合物，其特征在于，所述检测组合物包括SNP探针组合物和引物组合物；所述SNP探针组合物为分别设计于常染色体的66个SNP位点、X染色体的51个SNP位点、Y染色体的25个SNP位点的SNP探针对；所述引物组合物为用于扩增连接后的探针的带有index序列的通用引物，各所述探针对分别包括左侧探针和右侧探针，所述左侧探针的5
’
端和所述右侧探针的3
’
端分别包含一段通用序列，其作为所述通用引物扩增时的结合序列；其中，所述SNP探针对的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.284所示；所述通用引物的序列如SEQ ID NO.285～SEQ ID NO.286所示，左侧探针的5
’
端的通用序列如SEQ ID NO.287所示，右侧探针的3
’
端的通用序列如SEQ ID NO.288所示。2.根据权利要求1所述的SNP位点检测组合物，其特征在于，每一SNP探针对均各自具有3段用于司法鉴定的特征性序列；各所述探针对分别包括左侧探针和右侧探针，所述特征性序列分别为从左侧探针与模板DNA结合区域的左侧、左侧探针与右侧探针连接位置、右侧探针与模板DNA结合区域的右侧各截取的具有预定长度的碱基序列；其中，所述特征性序列的序列长度为10个碱基，所述特征性序列相互之间至少间隔一个碱基。3.一种基于MLPA
‑
NGS方法用于司法鉴定的SNP位点检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含如权利要求1或2所述的SNP位点检测组合物。4.根据权利要求3所述的SNP位点检测试剂盒，其特征在于，所述SNP探针组合物制备成探针工作液，所述探针工作液中每条探针浓度为0.2～20fmol/μL；和/或，所述引物组合物中，每一通用引物的配制浓度为2～200pMol。5.根据权利要求3所述的SNP位点检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括MLPA缓冲液、连接酶、连接酶缓冲液、PCR缓冲液、dNTP、PCR酶中的至少一种。6.一种如权利要求3～5中的任一项所述的SNP位点检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括步骤：DNA样品变性；SNP探针组合物与DNA样品进行探针杂交；采用连接酶和连接酶缓冲液与杂交探针进行连接反应；将探针连接产物与引物组合物进行PCR扩增；将PCR扩增产物测序，获得测序结果。7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，具体包括步骤：步骤S1、DNA变性和探针杂交：将DNA样品进行变性操作；将MLPA缓冲液与探针工作液充分混合，进行杂交反应，反应程序为：95℃2min，65℃至55℃，每降一度孵育1小时，然后在54℃保持3
‑
10小时，获得杂交产物；步骤S2、配制含有连接酶缓冲液的连接酶主液，将连接酶加入所述连接酶主液并混匀，54℃加热1分钟，于54℃恒温下加入所述杂交产物中混匀，继续孵育25分钟，于98℃加热5分钟，并冷却至20℃暂停，实现杂交探针的连接，获得连接产物；步骤S3、将所述连接产物与PCR反应液进行PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨永臣，夏超然，濮阳，
申请(专利权)人：江阴检汇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：