【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于5撇基因表达测定的寡核苷酸和珠
[0001]相关申请
[0002]本申请根据35 U.S.C.
§
119(e)要求2020年6月2日提交的美国临时专利申请序列第63/033716号的权益，此相关申请的内容为了所有目的通过引用以其整体并入本文。
[0003]对序列表的引用
[0004]本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表被提供为题为68EB_298731_WO的文件，创建于2021年5月26日，大小是4.0千字节。将电子格式的序列表的信息通过引用以其整体并入本文。
[0005]背景
[0006]领域
[0007]本公开内容总体上涉及分子生物学领域，并且特别涉及使用分子条形码化的多组学分析。
[0008]对相关技术的描述
[0009]分子条形码化的方法和技术可用于单细胞转录组学分析，包括使用例如逆转录、聚合酶链式反应(PCR)扩增和下一代测序(NGS)破译基因表达谱以确定细胞的状态。分子条形码化还可用于单细胞蛋白质组学分析。对使核酸靶分子在5
’
末端和3
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于对样品中的核酸靶进行标记的方法，所述方法包括：使核酸靶的拷贝与第一多于一种寡核苷酸条形码接触，其中所述第一多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含第一通用序列、第一分子标记和能够与所述核酸靶杂交的靶结合区；在存在逆转录酶和包含诱饵序列的模板转换寡核苷酸的情况下，延伸与所述核酸靶的拷贝杂交的所述第一多于一种寡核苷酸条形码，以产生多于一种条形码化核酸分子，所述多于一种条形码化核酸分子各自包含所述第一通用序列、所述第一分子标记、所述诱饵序列的互补物和与所述核酸靶的至少一部分互补的序列；使所述条形码化核酸分子与第二多于一种寡核苷酸条形码接触，其中所述第二多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含第二通用序列、第二分子标记和所述诱饵序列；以及延伸：(i)与所述第二多于一种寡核苷酸条形码的所述诱饵序列杂交的所述多于一种条形码化核酸分子的3
’
末端，以产生第一多于一种延伸的条形码化核酸分子，所述第一多于一种延伸的条形码化核酸分子各自包含第一分子标记、第一通用序列、所述第二分子标记的互补物和所述第二通用序列的互补物；和/或(ii)与所述条形码化核酸分子的所述诱饵序列的互补物杂交的所述第二多于一种寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的3
’
末端，以产生第二多于一种延伸的条形码化核酸分子，所述第二多于一种延伸的条形码化核酸分子各自包含第二分子标记、第二通用序列、所述第一分子标记的互补物和所述第一通用序列的互补物。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括基于以下确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数：(i)与所述第一多于一种延伸的条形码化核酸分子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记、具有不同序列的第二分子标记或其组合的数目；和/或(ii)与所述第二多于一种延伸的条形码化核酸分子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记、具有不同序列的第二分子标记或其组合的数目。3.一种用于确定样品中核酸靶的拷贝数的方法，所述方法包括：使核酸靶的拷贝与第一多于一种寡核苷酸条形码接触，其中所述第一多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含第一通用序列、第一分子标记和能够与所述核酸靶杂交的靶结合区；在存在逆转录酶和包含诱饵序列的模板转换寡核苷酸的情况下，延伸与所述核酸靶的拷贝杂交的所述第一多于一种寡核苷酸条形码，以产生多于一种条形码化核酸分子，所述多于一种条形码化核酸分子各自包含所述第一通用序列、所述第一分子标记、所述诱饵序列的互补物和与所述核酸靶的至少一部分互补的序列；使所述条形码化核酸分子与第二多于一种寡核苷酸条形码接触，其中所述第二多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含第二通用序列、第二分子标记和所述诱饵序列；延伸：(i)与所述第二多于一种寡核苷酸条形码的所述诱饵序列杂交的所述多于一种条形码
化核酸分子的3
’
末端，以产生第一多于一种延伸的条形码化核酸分子，所述第一多于一种延伸的条形码化核酸分子各自包含第一分子标记、第一通用序列、所述第二分子标记的互补物和所述第二通用序列的互补物；和/或(ii)与所述条形码化核酸分子的所述诱饵序列的互补物杂交的所述第二多于一种寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的3
’
末端，以产生第二多于一种延伸的条形码化核酸分子，所述第二多于一种延伸的条形码化核酸分子各自包含第二分子标记、第二通用序列、所述第一分子标记的互补物和所述第一通用序列的互补物；以及根据以下确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数：(i)与所述第一多于一种延伸的条形码化核酸分子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记、具有不同序列的第二分子标记或其组合的数目；和/或(ii)与所述第二多于一种延伸的条形码化核酸分子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记、具有不同序列的第二分子标记或其组合的数目。4.根据权利要求2
‑
3中任一项所述的方法，其中确定所述核酸靶的拷贝数包括基于与所述第一多于一种延伸的条形码化核酸分子中的延伸的条形码化核酸分子关联的具有不同序列的第一分子标记、具有不同序列的第二分子标记或其组合的数目来确定所述样品中多于一种核酸靶中的每一种的拷贝数，所述第一多于一种延伸的条形码化核酸分子包含所述多于一种核酸靶中的每一种的序列。5.根据权利要求2
‑
4中任一项所述的方法，其中确定所述核酸靶的拷贝数包括基于与所述第二多于一种延伸的条形码化核酸分子中的延伸的条形码化核酸分子关联的具有不同序列的第一分子标记、具有不同序列的第二分子标记或其组合的数目来确定所述样品中多于一种核酸靶中的每一种的拷贝数，所述第二多于一种延伸的条形码化核酸分子包含所述多于一种核酸靶中的每一种的序列。6.根据权利要求4
‑
5中任一项所述的方法，其中所述多于一种核酸靶中的每一种的序列包括所述多于一种核酸靶中的每一种的子序列。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中所述多于一种条形码化核酸分子中的所述核酸靶的序列包括所述核酸靶的子序列。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中所述靶结合区包含基因特异性序列，和/或多(dT)序列。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其中所述核酸靶包括mRNA，并且其中所述第二多于一种延伸的条形码化核酸分子各自包含所述核酸靶的有义链的序列。10.根据权利要求1
‑
9中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶能够具有末端转移酶活性。11.根据权利要求1
‑
10中任一项所述的方法，其中所述模板转换寡核苷酸包含一个或更多个3
’
核糖核苷酸，任选地三个3
’
核糖核苷酸，并且还任选地所述3
’
核糖核苷酸包括鸟嘌呤。12.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶包括病毒逆转录酶，任选地所述病毒逆转录酶是鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。13.根据权利要求1
‑
12中任一项所述的方法，其中所述样品包括单细胞，任选地免疫细
胞，并且进一步任选地B细胞或T细胞。14.根据权利要求1
‑
13中任一项所述的方法，其中所述样品包括多于一个细胞、多于一个单细胞、组织、肿瘤样品，或其任何组合。15.根据权利要求13
‑
14中任一项所述的方法，其中单细胞包括循环肿瘤细胞。16.根据权利要求1
‑
15中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码的所述第一通用序列在所述第一分子标记和所述靶结合区的5
’
。17.根据权利要求1
‑
16中任一项所述的方法，其中所述第二多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码的所述第二通用序列在所述第二分子标记和所述诱饵序列的5
’
。18.根据权利要求1
‑
17中任一项所述的方法，其中所述诱饵序列包含至少6个核苷酸。19.根据权利要求1
‑
18中任一项所述的方法，其中所述诱饵序列包含约20％至约80％的GC含量。20.根据权利要求1
‑
19中任一项所述的方法，其中延伸所述多于一种条形码化核酸分子的3
’
末端包括使用嗜中温DNA聚合酶、嗜热DNA聚合酶、嗜冷DNA聚合酶或其任何组合延伸所述多于一种条形码化核酸分子的3
’
末端。21.根据权利要求1
‑
20中任一项所述的方法，其中延伸所述多于一种条形码化核酸分子的3
’
末端包括使用缺乏5
’
至3
’
核酸外切酶活性和3
’
至5
’
核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶延伸所述多于一种条形码化核酸分子的3
’
末端，并且任选地所述DNA聚合酶包括Klenow片段。22.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法，其中延伸所述第二多于一种寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的3
’
末端包括使用嗜中温DNA聚合酶、嗜热DNA聚合酶、嗜冷DNA聚合酶或其任何组合延伸所述第二多于一种寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的3
’
末端。23.根据权利要求1
‑
22中任一项所述的方法，其中延伸所述第二多于一种寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的3
’
末端包括使用缺乏5
’
至3
’
核酸外切酶活性和3
’
至5
’
核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶延伸所述第二多于一种寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的3
’
末端，并且任选地所述DNA聚合酶包括Klenow片段。24.根据权利要求1
‑
23中任一项所述的方法，包括使用扩增引物和包含所述第一通用序列或其一部分的引物扩增所述第一多于一种延伸的条形码化核酸分子，从而产生包含所述核酸靶的序列或其一部分的第一多于一种单标记的核酸分子，其中确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数包括：基于与所述第一多于一种单标记的核酸分子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数。25.根据权利要求1
‑
24中任一项所述的方法，包括使用扩增引物和包含所述第二通用序列或其一部分的引物扩增所述第一多于一种延伸的条形码化核酸分子，从而产生包含所述核酸靶的序列或其一部分的第二多于一种单标记的核酸分子，其中确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数包括：基于与所述第二多于一种单标记的核
酸分子或其产物关联的具有不同序列的第二分子标记的数目来确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数。26.根据权利要求1
‑
25中任一项所述的方法，包括使用扩增引物和包含所述第二通用序列或其一部分的引物扩增所述第二多于一种延伸的条形码化核酸分子，从而产生包含所述核酸靶的序列或其一部分的第三多于一种单标记的核酸分子，其中确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数包括：基于与所述第三多于一种单标记的核酸分子或其产物关联的具有不同序列的第二分子标记的数目来确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数。27.根据权利要求1
‑
26中任一项所述的方法，包括使用扩增引物和包含所述第一通用序列或其一部分的引物扩增所述第二多于一种延伸的条形码化核酸分子，从而产生包含所述核酸靶的序列或其一部分的第四多于一种单标记的核酸分子，其中确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数包括：基于与所述第四多于一种单标记的核酸分子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数。28.根据权利要求24
‑
27中任一项所述的方法，其中所述扩增引物包含第三通用序列。29.根据权利要求24
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28中任一项所述的方法，其中所述扩增引物是靶特异性引物。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述靶特异性引物与以下特异性杂交：免疫受体、免疫受体的恒定区、免疫受体的可变区、免疫受体的多样性区，和/或免疫受体的可变区和多样性区的连接处。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述免疫受体是T细胞受体(TCR)和/或B细胞受体(BCR)，并且任选地所述TCR包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链或其任何组合；并且所述BCR受体包含BCR重链和/或BCR轻链。32.根据权利要求1
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31中任一项所述的方法，所述方法包括：使随机引物与所述第一多于一种延伸的条形码化核酸分子杂交并延伸所述随机引物以产生第一多于一种延伸产物，其中所述随机引物包含第三通用序列或其互补物；以及使用能够与所述第三通用序列或其互补物杂交的引物和能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物扩增所述第一多于一种延伸产物，从而产生第五多于一种单标记的核酸分子。33.根据权利要求1
‑
32中任一项所述的方法，所述方法包括：使随机引物与所述第二多于一种延伸的条形码化核酸分子杂交并延伸所述随机引物以产生第二多于一种延伸产物，其中所述随机引物包含第三通用序列或其互补物；以及使用能够与所述第三通用序列或其互补物杂交的引物和能够与所述第二通用序列或其互补物杂交的引物扩增所述第二多于一种延伸产物，从而产生第六多于一种单标记的核酸分子。34.根据权利要求1
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33中任一项所述的方法，其中所述第一通用序列、所述第二通用序列和/或所述第三通用序列是相同的或不同的。
35.根据权利要求1
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34中任一项所述的方法，其中所述第一通用序列、所述第二通用序列和/或所述第三通用序列包含测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述测序衔接子包括P5序列、P7序列、其互补序列和/或其部分。37.根据权利要求35
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36中任一项所述的方法，其中所述测序引物包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列和/或其部分。38.根据权利要求1
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37中任一项所述的方法，所述方法包括获得所述第一多于一种延伸的条形码化核酸分子或其产物的序列信息。39.根据权利要求38所述的方法，其中获得所述序列信息包括将测序衔接子附接到所述第一多于一种延伸的条形码化核酸分子或其产物。40.根据权利要求1
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39中任一项所述的方法，所述方法包括获得所述第二多于一种延伸的条形码化核酸分子或其产物的序列信息。41.根据权利要求40所述的方法，其中获得所述序列信息包括将测序衔接子附接到所述第二多于一种延伸的条形码化核酸分子或其产物。42.根据权利要求1
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41中任一项所述的方法，所述方法包括获得所述第一多于一种单标记的核酸分子、所述第二多于一种单标记的核酸分子、所述第三多于一种单标记的核酸分子、所述第四多于一种单标记的核酸分子、所述第五多于一种单标记的核酸分子和所述第六多于一种单标记的核酸分子，或其产物中的一种或更多种的序列信息。43.根据权利要求42所述的方法，其中获得所述序列信息包括将测序衔接子附接到所述第一多于一种单标记的核酸分子、所述第二多于一种单标记的核酸分子、所述第三多于一种单标记的核酸分子、所述第四多于一种单标记的核酸分子、所述第五多于一种单标记的核酸分子和所述第六多于一种单标记的核酸分子，或其产物中的一种或更多种。44.根据权利要求42
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43中任一项所述的方法，其中获得所述第一多于一种单标记的核酸分子、所述第二多于一种单标记的核酸分子、所述第三多于一种单标记的核酸分子、所述第四多于一种单标记的核酸分子、所述第五多于一种单标记的核酸分子和所述第六多于一种单标记的核酸分子，或其产物中的一种或更多种的序列信息包括：获得包含所述第一多于一种单标记的核酸分子、所述第二多于一种单标记的核酸分子...
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