一种选择性富集NAD帽修饰RNA的方法技术

本发明专利技术提出了一种选择性富集含有NAD帽修饰RNA的方法，具体地，本发明专利技术提出了一种选择性富集NAD帽修饰RNA的方法，该方法包括：1)将三磷酸酶yDcpS与待测RNA进行接触，获得准待测RNA，2)将式(I)所示化合物所述准待测RNA在腺苷二磷酸核糖基环化酶存在的条件下进行接触，以便使得式(I)所示化合物与所述准待测RNA中含有NAD帽修饰的RNA进行结合，通过亲和处理，以便获得NAD帽修饰的RNA，X

【技术实现步骤摘要】
一种选择性富集NAD帽修饰RNA的方法


[0001]本专利技术涉及生物领域，具体地，本专利技术涉及一种选择性富集NAD帽修饰RNA的方法。

技术介绍

[0002]真核细胞中的信使核糖核酸(以下简称：mRNA)通常具有5
’
端帽子修饰。长期以来，7
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甲基鸟苷酸(以下简称：m7G)被认为是真核细胞mRNA唯一的帽子修饰。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下简称：NAD)是细胞中重要辅酶因子。最新研究发现，NAD也可作为RNA 5
’
端帽子修饰(以下简称：NAD
‑
RNA)。NAD
‑
RNA在原核和真核生物体中广泛存在，表明其有可能参与基因调控。NAD是细胞氧化及多种代谢通路的核心辅酶，且NAD在自然衰老和衰老相关疾病过程中发生显著下降。系统表征NAD
‑
RNA的类型及丰度，为理解细胞生理及病理提供重要线索。

技术实现思路

[0003]专利技术人发现，目前现有技术中有两种方法用来富集含有NAD帽修饰的RNA。其中一种方法是利用NAD captureSeq技术，即在腺苷二磷酸核糖基环化酶(以下简称：ADPRC)的条件下利用4
‑
戊炔
‑1‑
醇将NAD的烟酰胺部分替换为含炔烃的分子，然后通过点击化学反应(铜催化的叠氮
‑
炔烃环加成CuAAC)将炔基化产物与生物素叠氮化物连接，并用链霉亲和素树脂富集生物素标记的RNA，最后通过二代测序技术(NGS)得到cDNA文库。该技术的缺点主要有两个：(1)金属铜离子的参与会导致RNA的严重降解导致RNA全长信息丢失，从而大大降低检测效率；(2)对于含有m7G帽子的RNA发生非特异性富集，从而影响NAD
‑
RNA检测准确性。另一种方法SPAAC
‑
NAD
‑
seq检测技术，即分为三步：(1)通过抗体免疫共沉淀的方法去除含有m7G帽子的RNA；(2)利用ADPRC催化反应将3
‑
叠氮基
‑1‑
丙醇将NAD的烟酰胺部分替换成为含叠氮化物；(3)通过炔烃环加成反应连接上生物素
‑
PEG4
‑
DBCO，进而用链霉亲和素树脂富集生物素标记的RNA，然后制备通过二代测序技术(NGS)测序得到cDNA文库。该技术的缺点也主要有两个：(1)步骤繁琐，多步反应降低总体检测效率；步骤1去除m7G帽子RNA后，需额外添加转运RNA(tRNA)以确保反应过程RNA总量不变；(2)多步反应造成RNA消耗，对RNA起始量要求高(不少于400微克总RNA)。
[0004]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。基于上述发现，本专利技术提出了无需金属铜离子，通过一步法富集含有NAD帽修饰的RNA的方法。本专利技术极大简化反应步骤，提高检测效率和准确性，且显著降低RNA用量。
[0005]在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种选择性富集NAD帽修饰RNA的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：1)将三磷酸酶yDcpS与待测RNA进行接触，获得准待测RNA，2)将式(I)所示化合物所述准待测RNA在腺苷二磷酸核糖基环化酶存在的条件下进行接触，以便使得式(I)所示化合物与所述准待测RNA中含有NAD帽修饰的RNA进行结合，通过亲和处理，以便获得NAD帽修饰的RNA，X
‑
L
‑
B(I)，其中，X代表亲核基团，L代表连接基团，B代表生物素或脱硫生物素，X与B通过L相连。专利技术人发现，三磷酸酶yDcpS前处理待测RNA，特异性去除含有m7G帽的RNA，可规避后续非特异性反应，进而极大简化反应步骤，提高检测效率和准确
性，且显著降低RNA用量。
[0006]根据本专利技术的实施例，上述方法还可以进一步包括如下技术特征至少之一：
[0007]根据本专利技术的实施例，X选自
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OH、
‑
SH、
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NH2、
‑
NHR、
‑
NRR
’
和含N杂芳基，R、R
’
分别独立地选自任选取代的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基。专利技术人发现，上述基团都可以和NAD帽上的烟酰胺基团发生亲核取代反应，且当X为OH时，亲核取代的效率能达到76％。
[0008]根据本专利技术的实施例，L选自n选自1、2或3。专利技术人发现，由于生物素或脱硫生物素疏水性很强，因此需要在生物素与亲核基团之间加入具有亲水性质的连接片段(L)，使最终的工具分子能以较高浓度在水溶性样品中稳定存在。通过比较PEG(带有氧原子)和全碳的烷烃链，带有PEG的工具分子在水溶性样品中具有更好的溶解性，因此用PEG作为底物分子的L部分。
[0009]根据本专利技术的实施例，式(I)所示化合物选自如下所示结构：
[0010][0011]根据本专利技术的实施例，式(I)所示化合物选自如下所示结构：
[0012][0013]在本专利技术的再一方面，本专利技术还提出了一种富集RNA的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括根据前面所述的方法富集NAD帽修饰的RNA。专利技术人发现，本专利技术实施例的方法操作简单并且效率高。
[0014]在本专利技术的再一方面，本专利技术还提出了一种构建测序文库的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括根据前面所述的方法富集RNA。
[0015]根据本专利技术的实施例，本专利技术具体如下优势效果至少之一：
[0016]1)三磷酸酶yDcpS前处理总RNA，特异性去除含有m7G帽的RNA，规避后续非特异性反应。
[0017]2)无需金属铜离子，通过一个反应即完成生物素标记含有NAD帽修饰的RNA，进而利用链霉亲和素实现NAD
‑
RNA的富集。
[0018]3)本专利技术极大简化反应步骤，提高检测效率和准确性，且显著降低RNA用量。
[0019]定义和一般术语
[0020]本专利技术将会把确定的具体化的内容所对应的文献详细列出，实施例都伴随有结构式和化学式的图解。本专利技术有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在本专利技术范围内。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本专利技术的实践中去。本专利技术绝非限于方法和物质的描述。有很多文献和相似的物质与本专利技术申请相区别或抵触，其中包括但绝不限于术语的定义，术语的用法，描述的技术，或如本专利技术申请所控制的范围。
[0021]本专利技术将应用以下定义除非其他方面表明。根据本专利技术的目的，化学元素根据元素周期表，CAS版本和化学物理手册，75
th Ed.，1994来定义。另外，有机化学一般原理见“Organic Chemistry”,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito,1999,和“March's Advanced Orga本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种选择性富集NAD帽修饰RNA的方法，其特征在于，包括：1)将三磷酸酶yDcpS与待测RNA进行接触，获得准待测RNA，2)将式(I)所示化合物所述准待测RNA在腺苷二磷酸核糖基环化酶存在的条件下进行接触，以便使得式(I)所示化合物与所述准待测RNA中含有NAD帽修饰的RNA进行结合，通过亲和处理，以便获得NAD帽修饰的RNA，X
‑
L
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B(I)，其中，X代表亲核基团，L代表连接基团，B代表生物素或脱硫生物素，X与B通过L相连。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，X选自
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OH、
‑
SH、
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NH2、
‑
NHR...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘南，牛孔艳，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：