基于宏基因组学快速确定微生物的方法及系统技术方案

本发明专利技术提供了一种基于宏基因组学快速确定微生物的方法及系统。所提供的方法包括：对待测样品进行破壁处理，获得破壁后产物，所述破壁处理包括酶解处理和物理破壁处理；对破壁后产物进行裂解处理，获取来自于待测样品的基因组DNA，并基于基因组DNA构建测序文库；对测序文库进行测序，以便获得测序数据；基于测序数据，与微生物数据库比对，确定所述待测样品中的微生物信息。根据所提供的方法可以高效、快速获得病原微生物物种信息，并用于疾病的检测。测。测。

【技术实现步骤摘要】
基于宏基因组学快速确定微生物的方法及系统


[0001]本专利技术涉及病原检测
，尤其涉及一种基于宏基因组学(mNGS)快速确定微生物的方法及系统。

技术介绍

[0002]呼吸道感染是全球范围内临床最常见的疾病之一，根据其部位分为上呼吸道感染和下呼吸道感染。前者包括鼻炎、咽炎和喉炎；后者包括气管炎、支气管炎和肺炎。根据全球疾病死亡率调查，急性呼吸道感染造成的死亡人数位居所有疾病造成死亡数的前列。引起呼吸道感染的病原体种类很多，其中包括细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体等，其临床表现与治疗措施存在差异。最常见的呼吸道病原体包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合孢病毒、流感嗜血杆菌、肺炎军团菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、念珠菌、霉菌、肺炎支原体、肺炎衣原体等。最近几年，又有新的呼吸道病原体在不断地被发现，如高致病性禽流感病毒、甲型流感毒H1N1以及新型冠状病毒2019
‑
nCoV等。
[0003]呼吸道病原体的检测方法很多，为临床疾病诊断和治疗提供了一定帮助，目前常见的临床检测方法主要有：病毒培养分离法、酶联免疫吸附法(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)等。这些方法只能针对已知特殊的病原体检测，检测时间较长、成本较高，其阳性率不高或存在家阳性率情况。而mNGS(宏基因组测序)技术在发现和转化研究的诸多方面已逐渐成为一种被广泛采用的技术，在急难危重感染性疾病的病原诊断分析中有重要应用，能够对样本中的所有核酸进行无偏向测序，包括人源和微生物的核酸。可以快速高效的检测样品中病原体种类。
[0004]然而通过宏基因组测序在呼吸道疾病的快速检测还需要进一步改进。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术提供了一种基于宏基因组学快速确定微生物的方法和系统。通过本专利技术所提供的确定微生物的方法和系统可以高效、快速进行呼吸道感染的检测。
[0006]本专利技术的第一方面提供了一种基于宏基因组学快速确定微生物的方法，所述方法包括：
[0007](1)对待测样品进行破壁处理，以便获得破壁后产物，所述破壁处理包括酶解处理和物理破壁处理；
[0008](2)对所述破壁后产物进行裂解处理，获取来自于所述待测样品的基因组DNA，并基于所述基因组DNA构建测序文库；
[0009](3)对所述测序文库进行测序，以便获得测序数据；
[0010](4)基于所述测序数据，与微生物数据库比对，确定所述待测样品中的微生物信息。
[0011]根据本专利技术的实施例，以上所述基于宏基因组学快速确定微生物的方法还可以进
一步包括如下技术特征：
[0012]根据本专利技术的实施例，所述酶解处理包括通过溶菌酶和溶壁酶处理。
[0013]根据本专利技术的实施例，所述溶菌酶的添加量为500
‑
3000U；所述溶壁酶的添加量为20
‑
200U。所提到的U为酶活蛋白。根据本专利技术的实施例，溶菌酶的添加量可以为500U～2500U、1000U～2500U、1500U～2500U、2000U～2500U等。溶壁酶的添加量为40～200U、60～200U、80～200U、100～200U、120～200U、140～200U、160～200U、180～200U等。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述酶解处理的条件为37摄氏度条件下酶解10～30分钟。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述物理破壁处理包括通过将待测样品和玻璃珠混合，进行高速震荡的步骤。
[0016]根据本专利技术的实施例，所述高速震荡的条件为50～80Hz的速度震荡1～3分钟，时间间隔为10～60秒，1～10个循环。
[0017]根据本专利技术的实施例，通过下述步骤获取所述待测样品的基因组DNA：将所述破壁后产物和载体RNA(carrier RNA)、裂解酶K和缓冲液混合，65℃下进行裂解反应，以便获得反应液；将所述反应液进行纯化，去除盐离子和有机试剂，以便获得来自于所述待测样品的基因组DNA。通过和载体RNA混合，可以提高微量样品中DNA的得率。
[0018]根据本专利技术的实施例，基于所述基因组DNA通过下述步骤构建测序文库：将所述基因组DNA进行酶切片段化处理，获得酶切产物；将所述酶切产物和测序接头连接，获得连接产物；对所述连接产物进行纯化与质控，以便得到测序文库。
[0019]根据本专利技术的实施例，所述酶切片段化处理包括采用非限制性核酸内切酶进行处理。
[0020]根据本专利技术的实施例，所述酶切片段化处理的反应体系为：50重量份基因组DNA和10重量份非限制性核酸内切酶混合。
[0021]根据本专利技术的实施例，所述酶切片段化处理的条件为在30
±
1℃的条件下孵育15
±
5min进行片段化，然后在72
±
1℃的条件下孵育25
±
5min进行变性处理；
[0022]根据本专利技术的实施例，所述基因组DNA的用量为50
‑
200ng。
[0023]根据本专利技术的实施例，所述连接反应体系为：60重量份所述酶切产物、30重量份连接缓冲液、5重量份核酸连接酶和5重量份测序接头核酸分子混合。
[0024]根据本专利技术的实施例，所述连接反应条件为在20
±
1℃的条件下孵育25
±
5min。
[0025]根据本专利技术的实施例，所述测序接头为退火Y型全长Unique dual index(UDI)，所述测序接头双端含8nt唯一样本标签(Index)。
[0026]根据本专利技术的实施例，步骤(3)中所述测序处理包括：测序文库定量，并稀释为0.5
‑
3.5pM，在测序仪上进行高通量测序的步骤。
[0027]根据本专利技术的实施例，步骤(4)进一步包括：(4
‑
1)基于特异性样本标签序列，将所述测序数据进行拆分，所述特异性样本标签序列用于区分不同的样本；(4
‑
2)将测序数据和宿主数据库比对，计算测序数据中的宿主序列比例，以便去除宿主序列；(4
‑
3)将去除宿主序列后的序列与微生物数据库进行比对，确定待测样品中的微生物信息。当对多个样品进行建库测序时，利用特异性标本标签序列区分不同的样品，可以同时实现对多个样品同时进行测序。
[0028]根据本专利技术的实施例，所述待测样品选自痰液、肺泡灌洗液、鼻腔粘液类样本中的
至少一种。
[0029]本专利技术的第二方面提供了一种基于宏基因组学快速确定微生物的系统，所述系统包括：
[0030]预处理模块，所述预处理模块用于对待测样品进行破壁处理，以便获得破壁后产物，所述破壁处理包括酶解处理和物理破壁处理；
[0031]测序文库构建模块，所述测序文库构建模块用于对所述破壁后产物进行裂解处理，获取来自于所述待测样品的基因组DNA，并本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于宏基因组学快速确定微生物的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)对待测样品进行破壁处理，以便获得破壁后产物，所述破壁处理包括酶解处理和物理破壁处理；(2)对所述破壁后产物进行裂解处理，获取来自于所述待测样品的基因组DNA，并基于所述基因组DNA构建测序文库；(3)对所述测序文库进行测序，以便获得测序数据；(4)基于所述测序数据，与微生物数据库比对，确定所述待测样品中的微生物信息。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解处理包括通过溶菌酶和溶壁酶处理；任选地，所述溶菌酶的添加量为500
‑
3000U；所述溶壁酶的添加量为20
‑
200U；任选地，所述酶解处理的条件为37摄氏度条件下酶解10～30分钟；任选地，所述物理破壁处理包括通过将待测样品和玻璃珠混合，进行高速震荡的步骤；任选地，所述高速震荡的条件为50～80Hz的速度震荡1～3分钟，时间间隔为10～60秒，1～10个循环。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过下述步骤获取所述待测样品的基因组DNA：将所述破壁后产物和载体RNA、裂解酶K和缓冲液混合，65℃下进行裂解反应，以便获得反应液；将所述反应液进行纯化，去除盐离子和有机试剂，以便获得来自于所述待测样品的基因组DNA。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于所述基因组DNA通过下述步骤构建测序文库：将所述基因组DNA进行酶切片段化处理，获得酶切产物；将所述酶切产物和测序接头连接，获得连接产物；对所述连接产物进行纯化与质控，以便得到测序文库；任选地，所述酶切片段化处理包括采用非限制性核酸内切酶进行处理；任选地，所述酶切片段化处理的反应体系为：50重量份基因组DNA和10重量份非限制性核酸内切酶混合；任选地，所述酶切片段化处理的条件为在30
±
1℃的条件下孵育15
±
5min进行片段化，然后在72
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1℃的条件下孵育25
±
5min进行变性处理；任选地，所述基因组DNA的用量为50
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200ng；任选地，所述连接反应体系为：60重量份所述酶切后产物、30重量份连接缓冲液、5重量份核酸连接酶和5重量份测序接头核酸分子混合；任选地，所述连接反应条件为在20
±
1℃的条件下孵育25
±
5min；任选地，所述测序接头为退火Y型全长Unique dual index(UDI)，所述测序接头双端含8nt唯一样本标签(Index)。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述测序处理包括：将定量稀释为0.5
‑
3.5pM的测序文库在测序仪上进行高通量测序的步骤；任选地，所述待测样品选自：痰液、肺泡灌洗液、鼻腔粘液类样本中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)进一步包括：(4
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1)基于特异性样本标签序列，将所述测序数据进行拆分，所述特异性样本标签序列用于区分不同的样本；(4
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2)将测序数据和宿主数据库比对，计算测序数据中的宿主序列比例，以便去除宿主序列；(4
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3)将去除宿主序列后的序列与微生物数据库进行比对，确定待测样品中的微生物信息。7.一种基于宏基因组学快速确定微生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：周斌，于雷，秦楠，
申请(专利权)人：上海锐翌生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：