用于猴痘病毒核酸检测的crRNA及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测的crRNA，以及采用上述crRNA的猴痘病毒核酸快速检测试剂盒。具体的，本发明专利技术提供了一种用于猴痘病毒核酸检测的crRNA，该crRNA包含如SEQ NO.12或SEQ NO.19所示的核苷酸序列。同时，本发明专利技术提供了一种猴痘病毒核酸检测试剂盒，试剂盒包括针对猴痘病毒基因的特异性扩增引物、上述crRNA中的一种或两种，CRISPR/Cas12a蛋白以及单链DNA(ssDNA)报告系统。本发明专利技术系首次实现采用CRISPR/Cas12a检测猴痘病毒，通过利用CRISPR/Cas12a特异识别猴痘病毒核酸，完成对猴痘病毒核酸的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。高特异性及快速可视化检测。高特异性及快速可视化检测。

【技术实现步骤摘要】
用于猴痘病毒核酸检测的crRNA及试剂盒


[0001]本专利技术涉及核酸快速检测领域，具体涉及一种用于猴痘病毒核酸检测的crRNA及相关检测试剂盒和制备方法。

技术介绍

[0002]猴痘(Monkeypox)是由猴痘病毒(Monkeypox virus，MP)引起的急性传染病。猴痘病毒于1958年被首次发现，当时一组用于研究的猴子中出现“痘状”传染病，因此得名。自世界卫生组织1980年宣布人类彻底消灭天花以来，猴痘病毒已成为对公共卫生影响最大的正痘病毒。该病传染性强，病死率为1
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10％。截止2022年6月16日，全球猴痘确诊病例突破2000,达到了2027例。猴痘病毒属于痘病毒科正痘病毒属，是对人类致病的4种正痘病毒属之一，另外3种是天花病毒、痘苗病毒和牛痘病毒。痘病毒科(Poxviridae)，是最大的一类DNA病毒,结构复杂。正痘病毒基因组为双链DNA，基因组大小在130
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375kb之间，包含大约190个开放性阅读框，编码213个蛋白。在猴痘治疗方面，目前暂无治疗猴痘感染的特效药。仅有部分药物可以使用。因此，猴痘需要早诊断、早治疗，实验室病原学诊断是猴痘病毒感染诊断的关键。
[0003]根据猴痘病毒的检测方法包括病毒培养和核酸检测。病毒培养方法利用采集的病理标本进行病毒培养，并分离猴痘病毒，该方法所需时间周期长，不利于快速鉴别，同时病毒培养环境条件要求严格，需要在三级及以上生物安全实验室开展。核酸检测采用核酸扩增检测方法在皮疹、疱液、痂皮、口咽或鼻咽分泌物等标本中可检测出猴痘病毒核酸。目前核酸检测的常见方法为常规聚合酶链反应(PCR)或实时荧光PCR。核酸检测可以是针对正痘病毒(OPXV)大类的，也可以是专门针对猴痘病毒(MPXV，MP)。第一步以PCR反应检测人类致病的OPXV，但不确定具体种类。然后可以进行第二步，可基于PCR或利用测序以专门检测MPXV。尽管如此，基于PCR的方法有严格的环境依赖和仪器依赖，不利于基层医疗机构或居家检测的推广应用。
[0004]等温扩增技术(isothermal amplification technology，IAT)是近年来发展起来的基于恒温扩增的新型核酸扩增技术。通过不同的酶和特异性引物在恒温条件下快速扩增，主要包括环介导等温扩增(loop
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mediated isothermal amplification，LAMP)、交叉引物扩增(crossing priming amplification，CPA)、链替代扩增(strand displacement amplification，SDA)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)、依赖核酸序列的扩增(nucleic acid sequence
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based amplification，NASBA)、滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)和依赖解旋酶的扩增(helicase
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dependent amplification，HDA)等。与PCR方法相比，等温扩增技术使用的仪器设备简单且扩增时间缩短。目前已有研究利用LAMP技术对猴痘病毒进行快速鉴定。尽管如此，LAMP方法涉及到引物较多和引物设计要求较高等问题，从而限制了其在病原检测中的应用，此外，等温扩增还需克服非特异性扩增的假阳性瓶颈。
[0005]近年来，以Crispr/cas9为代表的基因编辑系统发展迅猛，高效率的精准DNA、RNA
编辑已广泛应用于生物医学、农业等诸多领域。同时，人们发现部分Crispr系统，如Cas12a/b,Cas13在被激活后还具有非特异性的核酸剪切活性，如来自Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cas12a(LbCas12a)，在引导RNA引导(例如天然crRNA)下，能够快速的降解单链M13DNA噬菌体，由此提出了LbCas12a在与靶DNA结合后具有强大的非特异性裂解单链DNA(single
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stranded DNA，ssDNA)的能力，即“附属切割”活性。至此以后，基于“附属切割”活性，结合携带荧光的单链DNA，开发了多种特异性靶序列检测技术，这使得该技术不仅仅可以用于核酸编辑还可以用于核酸变异检测。因此，基于Crispr系统的核酸检测技术在理论上可以具有较高的特异性，弥补等温扩增特异性不足的问题，但其灵敏度有限，更为重要的是，引导RNA，如crRNA或gRNA的容错率较高，很难对单碱基突变进行分辨。目前尚无基于Crispr系统的猴痘病毒检测技术的报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供一种基于CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测的crRNA，以及采用上述crRNA的猴痘病毒核酸快速检测试剂盒。
[0007]根据第一方面，本专利技术提供了一种用于猴痘病毒核酸检测的crRNA，该crRNA包含如SEQ NO.12或SEQ NO.19所示的核苷酸序列。
[0008]进一步的，本专利技术中的crRNA的5
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端包含发夹序列，在本专利技术的一种具体实施方式，该发夹序列如SEQ NO.23所示。
[0009]同时，本专利技术还提供了上述crRNA的制备方法，包括：针对猴痘病毒crmB基因区、猴痘病毒基因46428
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46723区，寻找包含CRISPR/Cas12a识别序列的靶向序列，设计20
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23nt长度的核苷酸序列(该核苷酸序列可与待测靶DNA特异性识别)，通过体外转录或者合成获得上述crRNA。
[0010]根据第二方面，本专利技术提供了一种猴痘病毒核酸检测试剂盒，试剂盒包括上述crRNA中的一种或两种。上述试剂盒还可进一步包括针对猴痘病毒基因的特异性扩增引物、上述crRNA，CRISPR/Cas12a蛋白以及单链DNA(ssDNA)报告系统。
[0011]具体的，上述针对猴痘病毒基因的特异性扩增引物包括针对猴痘病毒crmB基因区和/或针对猴痘病毒基因46428
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46723区的特异性扩增引物。上述单链DNA报告系统包括ssDNA FQ reporter或ssDNA DB reporter。上述CRISPR/Cas12a蛋白为LbCas12a蛋白。
[0012]本专利技术的有益效果在于：本专利技术系首次实现采用CRISPR/Cas12a检测猴痘病毒，通过利用CRISPR/Cas12a特异识别猴痘病毒核酸，完成对猴痘病毒核酸的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。基于CRISPR/Cas12a识别特定PAM序列特点，根据猴痘病毒基因靶序列设计得到特异性crRNA。通过检测实验验证了所设计的crRNA能有效屏蔽其他正痘病毒而特异性识别猴痘病毒，进而提供了一种基于CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸快速检测试剂盒，该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备等优势本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于猴痘病毒核酸检测的crRNA，其特征在于，所述crRNA包含如SEQ NO.12或SEQ NO.19所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的crRNA，其特征在于，所述crRNA的5
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端包含发夹序列；优选的，所述发夹序列如SEQ NO.23所示。3.一种猴痘病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于猴痘病毒核酸检测的crRNA，所述crRNA包括：含有如SEQ NO.12所示的核苷酸序列的crRNA；和/或，含有如SEQ NO.19所示的核苷酸序列的crRNA；优选的，所述crRNA的5
’
端包含发夹序列；进一步优选的，所述发夹序列如SEQ NO.23所示。4.如权利要求3所述的猴痘病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括CRISPR/Cas12a蛋白；优选的，所述CRISPR/Cas12a蛋白为LbCas12a蛋白。5.如权利要求3所述的猴痘病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对猴痘病毒基因的特异性扩增引物；优选的，所述针对猴痘病毒基因的特异性扩增引物包括针对猴痘病毒crmB基因区和/或针对猴痘病毒基因46428
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46723区的特异性扩增引物。6.如权利要求5所述的猴痘病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述针对猴痘病毒crmB基因区的特异性扩增引物包括：MPoxL1和MPoxR1，其序列分别如SEQ NO.8和SEQ NO.9所示；和/或...

【专利技术属性】
技术研发人员：李勇，赵健博，彭智宇，王少伟，
申请(专利权)人：深圳华大医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：