双交叉引物扩增联合CRISPR-Cas12a检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的系统技术方案

本发明专利技术提供一种双交叉引物扩增联合CRISPR

【技术实现步骤摘要】
双交叉引物扩增联合CRISPR
‑
Cas 12a检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的系统


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种双交叉引物扩增联合CRISPR
‑
Cas 12a检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的系统。

技术介绍

[0002]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin
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resistant staphylococcus aureus，MRSA)是一种主要的医院和社区获得性病原体，能引起如手术伤口感染、肺炎、心内膜炎、败血症等严重感染。甲氧西林的抗性是由于mecA基因的存在，mecA基因能编码修饰的青霉素结合蛋白，降低对β
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内酰胺药物的亲和性。MRSA能被健康的人群携带而不引起任何疾病，但当这些健康的携带者进入医院，能够感染住院的病人。此外，病人也可以感染自己，例如，如果一个人经受外科手术，感染的风险就会增加。MRSA健康携带者构成了MRSA的储存体，必须对这些携带者进行筛选以通过局部净化根除所述株。现在MRSA筛选被认为是在世界范围内减少MRSA株流行的主要方法。通常，在病人的MRSA检测中，从病人身上得到鼻拭子并反复培养，以鉴定MRSA株是否存在。可以通过从鼻拭子上直接鉴定检测而取消培养的需要。培养物鉴定方法通常需要最少24小时，更通常的是72小时，以获得结果。新的显色培养基(培养基中含有基质，一般是抗生素如头孢西丁来选择抗甲氧西林的株)能够潜在地减少所述时间而导致24～48小时的时间周期。然而，在MRSA感染的病例中，需要在几小时内得到结果，因为病人应该被隔离直到得知结果。因此，极需一种能在几小时内得到结果的可靠的MRSA的分子检测方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种双交叉引物扩增联合CRISPR
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Cas 12a检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的系统，该系统检测结果可靠，且检测时间短，有重要的临床实际意义。
[0004]除特殊说明外，本专利技术所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。
[0005]为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0006]一种双交叉引物扩增联合CRISPR
‑
Cas 12a检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的系统，其特征在于：首先将从样本中提取的核酸产物进行交叉引物扩增(Cross priming amplification，CPA)，随后将产生的dsDNA引入CRISPR Cas12a系统中，利用该系统的识别双链后的反式切割作用，对体系中的报告分子进行切割，随后依靠免疫层流试纸条实现信号转化和输出，实现致病菌的特异性检测；
[0007]所述交叉引物扩增CPA的序列选自mecA
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CF和mecA
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CB、mecA
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DF和mecA
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DB、nuc
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CF和nuc
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CB、nuc
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DF和nuc
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DB中的一对或几对；上述DNA序列如下表1所示：
[0008]表1DNA序列
[0009][0010]根据本专利技术的一个实施方案，上述系统中的等温扩增体系为：mecA
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CF、mecA
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CB、nuc
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CF和nuc
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CB各0.4μM，mecA
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DF、mecA
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DB、nuc
‑
DF和nuc
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DB各0.8μM，0.5mM dNTP，2μL10
×
Bst buffer，6U Bst DNA聚合酶，4mM MgSO4，0.5M甜菜碱，1μL细菌DNA提取液。
[0011]根据本专利技术的一个实施方案，上述系统中crRNA和Cas 12a的比例为1：1。
[0012]根据本专利技术的一个实施方案，上述系统中crRNA和Cas 12a蛋白的浓度为5nM
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50nM，优选50nM。
[0013]根据本专利技术的一个实施方案，上述系统中DNA报告分子的浓度为50nM
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300nM，优选50nM
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200nM。
[0014]根据本专利技术的一个实施方案，上述系统中反应时间为30min
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60min，优选30min。
[0015]根据本专利技术的一个实施方案，上述系统中反应体系中crRNA和Cas 12a蛋白的浓度确定为20nM、DNA报告分子浓度确定为200nM、反应时间为30分钟，试纸条上报告分子浓度也为200nM。
[0016]有益效果
[0017]本专利技术提供一种基于CPA、CRISPR Cas12a系统和层流试纸条的快速检测金黄色葡萄球菌和MRSA新方法。与传统的培养鉴定法不同，本方案能够在3小时内快速识别金黄色葡萄球菌和MRSA，具有很高的临床转化潜力。利用菌悬液对本方案进行验证，最低检测限能达到5CFU/mL；利用临床样本对本方法进行临床验证，相较于传统方法，具有更高的灵敏度，能够成功应用于临床样本的检测。总体而言，本专利技术为细菌的分子诊断中基于CPA和CRISPR Cas12a放大系统提供了一种新的解决方案。
附图说明
[0018]图1是目的基因CPA反应体系的引物设计示意图：(A)Nuc基因的引物和PAM位点，(B)mecA基因的引物和PAM位点；
[0019]图2是基于双交叉引物CPA联合CRISPR
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Cas12a酶的双重放大系统检测细菌的原理示意图；
[0020]图3是CPA放大系统示意图及电泳验证；
[0021]图4是CPA联合CRISPR
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Cas 12a的双重放大系统电泳表征图；
[0022]图5是优化检测条件结果图：(A)crRNA和Cas 12a蛋白的浓度，(B)DNA报告分子浓度，(C)反应时间，(D)试纸条上DNA报告分子浓度
[0023]图6是评估生物传感策略的可行性。(A)不同浓度的金黄色葡萄球菌绝对菌落培养
计数。(B)CPA联合CRISPR
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Cas 12a法检测不同浓度菌悬液的结果图。(C)CPA联合CRISPR
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Cas 12a法结果图中条带灰度值的截面图。
具体实施方式
[0024]下面通过具体实施例对本专利技术进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述
技术实现思路
对本专利技术作出一些非本质的改进和调整。本专利技术所用原料及试剂均为市售产品。
[0025]实施例1
[0026](1)材料与试剂
[0027]本实验用于核酸提取的硅化磁珠来自广州达安基因股份有限公司，盐酸胍(Gu
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HCl)购自上海麦克林生化科技股份有限公司本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双交叉引物扩增联合CRISPR
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Cas 12a检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的系统，其特征在于：首先将从样本中提取的核酸产物进行交叉引物扩增(Cross priming amplification，CPA)，随后将产生的dsDNA引入CRISPR Cas12a系统中，利用该系统的识别双链后的反式切割作用，对体系中的报告分子进行切割，随后依靠免疫层流试纸条实现信号转化和输出，实现致病菌的特异性检测；所述交叉引物扩增CPA的序列选自mecA
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CF和mecA
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CB、mecA
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DF和mecA
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DB、nuc
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CF和nuc
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CB、nuc
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DF和nuc
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DB中的一对或几对，如下表1所示：表1DNA序列2.如权利要求1所述的系统，其特征在于：系统中的等温扩增体系为：mecA
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CF、mecA
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CB、nuc
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CF和nuc
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CB各0.4μM，mecA
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DF、mecA
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DB、nuc
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DF和nuc
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【专利技术属性】
技术研发人员：吴茳铃，黄昱，薛建江，程伟，刘刚，康李娜，王晓亮，李丹丹，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属大学城医院，
类型：发明
国别省市：