一种基于核心基因设计的茄科雷尔氏菌检测引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于核心基因设计的茄科雷尔氏菌检测引物及其应用。本发明专利技术提供了一种用于鉴定或者辅助鉴定茄科雷尔氏菌的引物对，是根据茄科雷尔氏菌基因组中CDC45_RS17435基因设计得到的，所述引物对由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示两条单链DNA组成。本发明专利技术可以应用于实际生产的茄科雷尔氏菌快速定量检测方法，有助于解决我国实际生产中面临的细菌性青枯病防治问题。细菌性青枯病防治问题。

【技术实现步骤摘要】
一种基于核心基因设计的茄科雷尔氏菌检测引物及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于核心基因设计的茄科雷尔氏菌检测引物及其应用。

技术介绍

[0002]茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是一种革兰氏阴性植物病原细菌，由其造成的细菌性青枯病是一种毁灭性的土传病害。茄科雷尔氏菌在全球范围内均有分布，在我国主要分布于南方地区。在无寄主植物时，茄科雷尔氏菌也可在土壤或者水体中存活若干年，在有合适的寄主植物时，茄科雷尔氏菌可以从根部或者茎基部的伤口或自然开口侵染植物，并在木质部大量繁殖，致使植物体内的正常水分运输途径受阻，造成植株缺水萎蔫甚至死亡。茄科雷尔氏菌是一个复合种，可以划分为4个演化型，其中，在我国的分布主要以演化型I为主。茄科雷尔氏菌可以侵染50余科200余种植物，并且其发病速度较快，一旦发病就会影响作物产量，严重影响我国农产品质量与农业经济的发展。因此在发病前或发病早期对茄科雷尔氏菌的种群密度进行检测，通过生物防治或者化学防治的方法进行干预，可以有效防止细菌性青枯病的大面积爆发。
[0003]随着现代分子生物学的发展，PCR技术已经广泛应用于病原菌种群动态的监控、检测及预警。相比于传统的平板涂布计数法和平板划线分离法，PCR技术具有检测时间短且准确度高的优点，可以大大提高检测效率。目前，该技术应用于实际生产的主要难点在于寻找特异性引物的靶标基因。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于利用茄科雷尔氏菌中保守的直系同源基因为靶点，设计并验证针对茄科雷尔氏菌快速定量检测所适用的特异性引物，解决农业生产中面临的细菌性青枯病防治问题。
[0005]OrthoFinder是目前在比较基因组学研究中一个常用的工具，具有运行快速、全面、准确的优点。它可以找到正交群和直系同源物，并对所有正交群的根基因树进行推断，识别这些基因树中所存在的基因重复事件。直系同源基因又称垂直同源基因，指的是从同一祖先垂直进化而来的基因，一般具有编码序列及功能保守的特点。本专利技术利用OrthoFinder分析茄科雷尔氏菌中存在的直系同源基因，寻找序列保守的基因靶标，根据基因的保守核苷酸位点设计茄科雷尔氏菌快速检测的特异性引物，并使用NCBI数据库进行特异性验证，从而提供一种可以应用于实际生产的茄科雷尔氏菌快速定量检测方法，有助于解决我国实际生产中面临的细菌性青枯病防治问题。
[0006]第一方面，本专利技术要求保护用于鉴定或者辅助鉴定茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的引物对。
[0007]本专利技术所要求保护的引物对是根据如下(I)或(II)设计得到的：
[0008](I)茄科雷尔氏菌基因组中CDC45_RS17435基因；
[0009](II)以茄科雷尔氏菌基因组为模板，采用由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示两条单链DNA组成的引物对进行扩增后所得扩增产物。
[0010]进一步地，所述引物对由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示两条单链DNA组成。
[0011]第二方面，本专利技术要求保护含有前文第一方面所述引物对的试剂或试剂盒。
[0012]进一步地，所述试剂盒中，除了所述引物对外还可含有其他PCR常规试剂。
[0013]第三方面，本专利技术要求保护前文第一方面中所述引物对或前文第二方面中所述试剂或试剂盒在如下任一中的应用：
[0014](A1)鉴定或者辅助鉴定茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)；
[0015](A2)鉴定或者辅助鉴定待测菌株是否为茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)；
[0016](A3)检测或辅助检测待测样本中是否含有茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)；
[0017](A4)对青枯病进行预防、监测和/或预警；
[0018](A5)对土壤和/或植物样品中的茄科雷尔氏菌种群密度进行定量检测。
[0019]第四方面，本专利技术要求保护一种鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的方法。
[0020]本专利技术要求保护额鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的方法，可包括如下步骤：
[0021]以待测菌株的基因组DNA为模板，采用前文第一方面所述引物对(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)进行PCR扩增，得到扩增产物，然后按照如下确定所述待测菌株是否为茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)：若所述扩增产物中含有141bp目的片段，则所述待测菌株为或候选为茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)；反之，则所述待测菌株不为或候选不为茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。
[0022]第五方面，本专利技术要求保护一种检测或辅助检测待测样本中是否含有茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的方法。
[0023]本专利技术要求保护的检测或辅助检测待测样本中是否含有茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的方法，可包括如下步骤：
[0024]从待测样本中提取总DNA，以所述总DNA为模板，采用前文第一方面所述引物对(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)进行PCR扩增，得到扩增产物，然后按照如下确定所述待测样本中是否含有茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)：若所述扩增产物中含有141bp目的片段，则所述待测样本中含有或候选含有茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)；反之，则所述待测样本中不含有或候选不含有茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。
[0025]在前文第四和第五方面所述方法中，进行所述PCR扩增时的退火温度可为62℃。
[0026]进一步地，进行所述PCR扩增时的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
[0027]在(B1)和(C1)中，进行所述PCR扩增时的反应体系中，所述引物对中正向引物(SEQ ID No.1)和反向引物(SEQ ID No.2)的浓度均为10μM。
[0028]进一步地，进行所述PCR扩增时的反应体系为20μL，包括10μL 2
×
Taq PCR Master Mix(康润生物)，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL土壤样品DNA，7μL ddH2O，其中正向引物与
反向引物浓度均为10μM，土壤样品DNA总量在20ng
‑
2μg之间。
[0029]在本专利技术中，所述PCR既可以为普通PCR(用于定性检测)，也可以为荧光定量PCR(用于定量检测)。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于鉴定或者辅助鉴定茄科雷尔氏菌的引物对，是根据如下(I)或(II)设计得到的：(I)茄科雷尔氏菌基因组中CDC45_RS17435基因；(II)以茄科雷尔氏菌基因组为模板，采用由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示两条单链DNA组成的引物对进行扩增后所得扩增产物。2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述引物对由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示两条单链DNA组成。3.含有权利要求1或2所述引物对的试剂或试剂盒。4.权利要求1或2所述引物对或权利要求3所述试剂或试剂盒在如下任一中的应用：(A1)鉴定或者辅助鉴定茄科雷尔氏菌；(A2)鉴定或者辅助鉴定待测菌株是否为茄科雷尔氏菌；(A3)检测或辅助检测待测样本中是否含有茄科雷尔氏菌；(A4)对青枯病进行预防、监测和/或预警；(A5)对土壤和/或植物样品中的茄科雷尔氏菌种群密度进行定量检测。5.一种鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为茄科雷尔氏菌的方法，包括如下步骤：以待测菌株的基因组DNA为模板，采用权利要求2所述引物对进行PCR扩增，得到扩增产物，然后按照如下确定所述待测菌株是否为茄科雷尔氏菌：若所述扩增产物中含有141bp目的片段，则所述待测菌株...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏海雷，马毅楠，从珅，廖开吉，谷医林，李俊州，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，
类型：发明
国别省市：