一种用于检测梅毒螺旋体的RPA引物组、试剂、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物检测的技术领域，具体涉及一种用于检测梅毒螺旋体的RPA引物组、试剂、试剂盒及其应用，所述RPA引物组的额核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：上游引物：5

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测梅毒螺旋体的RPA引物组、试剂、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物检测的
，具体涉及一种用于检测梅毒螺旋体的RPA引物组、试剂、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum，Tp)引起的慢性、系统性传播疾病，是《中华人民共和国传染病防治法》中的乙类防止管理病种。其病程复杂，临床上表现为一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒、潜伏梅毒和先天梅毒等。早期侵犯生殖器和皮肤，晚期侵犯全身各器官，可通过性行为传播，母婴传播，危害性极大。梅毒的防止主要在于早发现、早诊断和早治疗，其诊断仍主要根据临床表现、镜检出病原体和血清学检测为主。梅毒感染是全球性的公共卫生问题，近年来随着科技发展，对梅毒的准确及时检测也在不断改进简化。
[0003]近年来，随着分子生物学技术的发展，快速、灵敏和特异性高的梅毒诊断方法得到了不断的更新完善。梅毒螺旋体的基因序列已测序完成，因此基于梅毒DNA建立分子生物学检测方法如聚合酶链式反应(PCR)和荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR)可以克服血清学检测的缺点。但传统基于PCR的方法需要变性、退火、延伸三个步骤，每个步骤的温度不一样，需要专门的热循环仪来进行，限制了其使用范围。
[0004]RPA技术(重组酶聚合物扩增技术)是一项新型的等温扩增技术，被称为可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右，其主要原理是重组酶与引物结合形成的蛋白
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DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。
[0005]因此，开发出一种用于梅毒螺旋体RPA引物对于梅毒螺旋体的检测具有重要意义。

技术实现思路

[0006]针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种用于检测梅毒螺旋体的RPA引物组、试剂、试剂盒及其应用。
[0007]本专利技术的
技术实现思路
如下：
[0008]本专利技术提供了一种用于检测梅毒螺旋体的RPA引物组，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
[0009]上游引物SEQ ID NO.1：5
’‑
acacaggttgcagagcagacacgtaaaaccggc
‑3’
；
[0010]下游引物SEQ ID NO.2：5
’‑
ctgcagcaacaattgtgcacgtaacggtcggcg
‑3’
；
[0011]所述上游引物的5
’
端采用FAM进行标记；
[0012]所述下游引物的5
’
端采用生物素进行标记。
[0013]本专利技术还提供了一种用于检测梅毒螺旋体的RPA试剂，所述RPA试剂包括上述RPA引物组；
[0014]所述RPA试剂中，RPA引物组中的上游引物和下游引物的浓度为10～20μmol/L。
[0015]本专利技术还提供了一种用于检测梅毒螺旋体的试剂盒，所述试剂盒包括上述RPA引物组、RPA试剂以及侧向流试纸条。
[0016]本专利技术还提供了上述引物或上述试剂在制备梅毒螺旋体及其产品的检测产品的应用。
[0017]本专利技术还提供了上述试剂盒在梅毒螺旋体及其产品检测中的应用。
[0018]本专利技术还提供了一种用于梅毒螺旋体的RPA检测方法，包括如下步骤：
[0019]1)将上述RPA引物对待测病毒进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；
[0020]所述RPA扩增的模板为待测病毒的DNA；
[0021]2)将RPA扩增产物滴加在试纸条加样区，根据试纸条上产生的条带情况分析待测病毒是否为梅毒螺旋体，若试纸条上产生两条清晰条带，则所述待测病毒为梅毒螺旋体；若试纸条上仅产生一条质控条带，则所述待测病毒中不含梅毒螺旋体；
[0022]所述RPA扩增的温度37℃，扩增时间为20～60min。
[0023]本专利技术的有益效果如下：
[0024]本专利技术的用于检测梅毒螺旋体的RPA引物组，为针对梅毒螺旋体的DNA序列设计得到，用于对梅毒螺旋体的定性检测，所述RPA引物组具有特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊仪器、适用范围广，最低能检测拷贝数为100copies/μL的梅毒螺旋体DNA，具体有如下优点：仅需一对引物即可完成扩增，不需要复杂的引物设计过程；只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；反应时间仅需20
‑
60min；结果易于判断；检测灵敏度高，可检测到血液样本中提取的梅毒螺旋体DNA。本专利技术基于RPA的检测方法灵敏、准确、简便和快速，对临床相关疾病检验具有指导意义；
[0025]本专利技术的用于检测梅毒螺旋体的试剂盒，采用RPA引物或试剂，以及试纸条，本专利技术的方法，能够特异地检测梅毒螺旋体，且与其他病原体无交叉反应。与现有检测梅毒螺旋体的其它技术和同类技术相比，本专利技术技术方案有如下优点：首先，与传统的PCR或其他分子检测技术相比，本专利技术提供的重组酶聚合酶等温扩增技术快速检测淋病奈瑟菌的可视化方法，能够在恒温条件下进行(个人体温亦可完成检测反应)，不需要较昂贵的PCR仪等热循环设备，不受实验空间的限制；其次，本专利技术提供的检测方法在恒温条件下实现对梅毒螺旋体核酸的快速、特异的扩增，整个检测流程，从样本核酸提取到结果判读能在30min内完成，具有良好的操作性，远快于PCR技术或其他等温扩增方法。
附图说明
[0026]图1为CEV的RAA检测引物筛选的凝胶结果图(M：分子量Marker；1：第一组引物扩增结果；2：第二组引物扩增结果)；
[0027]图2为本专利技术中用于检测和/或辅助检测梅毒螺旋体的引物组特异性检测结果图(CT衣原体；GC：淋球菌；GBS:B族链球菌；MP：支原体；TP：梅毒螺旋体)；
[0028]图3为图2为RPA
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LFD法对TRP的灵敏度实验图。
具体实施方式
[0029]以下通过具体的实施案例以及附图说明对本专利技术作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的保护范围，在阅读了本专利技术之后，本领域技术人员对本专利技术的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
[0030]若无特殊说明，本专利技术的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
[0031]本专利技术实施例所采用的梅毒螺旋体DNA来源为血液样本，为中国科学院大学深圳医院(光明)提供。
[0032]本专利技术实施例RPA扩增反应为采用英国TwistDx Inc公司的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测梅毒螺旋体的RPA引物组，其特征在于，所述RPA引物组的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；上游引物SEQ ID NO.1：5
’‑
acacaggttgcagagcagacacgtaaaaccggc
‑3’
；下游引物SEQ ID NO.2：5
’‑
ctgcagcaacaattgtgcacgtaacggtcggcg
‑3’
。2.根据权利要求1所述的用于检测梅毒螺旋体的RPA引物组，其特征在于，所述上游引物的5
’
端采用FAM进行标记；所述下游引物的5
’
端采用生物素进行标记。3.一种用于检测梅毒螺旋体的RPA试剂，其特征在于，所述RPA试剂包括权利要求1所述的RPA引物组。4.根据权利要求3所述的用于检测梅毒螺旋体的RPA试剂，其特征在于，所述RPA试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡祥胜，梁欣，王东松，
申请(专利权)人：深圳市鸿琪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：