一种快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT-RPA检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术属于生物鉴定技术领域，具体涉及一种快速鉴定鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT
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RPA检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于生物鉴定
，具体涉及一种快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT
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RPA检测试剂盒及检测方法，具体是针对鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i
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的双重RT
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RPA检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]鼠伤寒沙门菌是引起食源性疾病最常见的血清型之一。沙门菌血清型4,[5],12:i:
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，是一种鼠伤寒沙门菌单相变种，在20世纪90年代前很少分离到，但目前该血清型已经逐渐成为人类临床、食品动物和肉食品中的最主要血清型之一，威胁着人类公共卫生安全。多项研究已经表明，猪肉及其制品的污染，是沙门菌血清型4,[5],12:i:
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引起人类健康风险的重要原因。同时，沙门菌血清型4,[5],12:i:
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可能对猪具有鼠伤寒沙门菌相似的致病潜力。为了保护人类健康，维护食品公共卫生安全，针对临床样品、猪肉等食物、病猪源样品中分离获得沙门菌并对其进行鉴定十分必要。
[0003]目前，对于鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i:
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的检测，仍旧依靠传统的常规血清学鉴定方法、聚合酶链式反应（PCR）和荧光定量PCR法，这些方法存在耗时长、操作繁琐、劳动量大的缺陷，常规血清学方法除了上述缺陷还具有成本高的问题。因此引进一种新的能够快速鉴定鼠伤寒沙门菌和沙门菌血清型4,[5],12:i:
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的方法也十分必要。
[0004]重组酶聚合酶扩增( recombinase polymerase amplification，RPA) 是近年来兴起的一种等温核酸扩增技术，具有灵敏度高、特异性强、反应快速等特点，利用重组酶代替PCR的高温解链， 在37℃～42 ℃环境条件下完成对双链的解链，采用单链结合蛋白防止解链的DNA 复性，由DNA 聚合酶实现链的延伸，实现DNA的扩增，整个反应20 min 内完成，目前根据RPA产物检测方法，又将RPA分为直接重组酶聚合酶扩增技术( Direct－RPA)、重组酶聚合酶扩增侧流层析技术( RPA－LFD)、实时重组酶聚合酶扩增技术( RT－RPA)等。而该技术在鼠伤寒沙门菌和沙门菌血清型4,[5],12:i:
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鉴定上目前还少有公开，亟需展开相关研究。

技术实现思路

[0005]针对传统的常规血清学鉴定方法在鉴定鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i:
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存在的缺陷和问题，本专利技术提供一种快速鉴定鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i
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的双重RT
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RPA试剂盒及其检测方法。该方法针对鼠伤寒沙门菌、沙门菌血清型4,[5],12:i:
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均携带的STM4495基因以及鼠伤寒沙门菌携带的fljB1,2 基因基于实时荧光重组酶聚合酶扩增技术（RT
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RPA），对鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i
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进行快速鉴定。
[0006]本专利技术解决其技术问题所采用的方案是：一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT
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RPA引物组，其核苷酸序列如下所示：4495F5：GTATTTGATTCTTTATTTGTGATAAGGGTT；
4495R3：CGCCACCATAAAAAACTTGGAGAAAAAAT；H2F1：TAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACT；H2R5：TCGCACCAGCAGGCATTGTGGTTTTAGTTG。
[0007]本专利技术还提供一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT
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RPA探针，其核苷酸序列如下所示：STM4495probe：TATTGAAACCTCGTACCAATATCTTTGAAA[ROX
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dT][THF][BHQ2
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dT]AATATTGTCACCGG
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C3 Spacer；H2 probe：CGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGACGG[FAM
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dT]A[THF]AG[BHQ1
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dT]AACCCTTGCGGCTG
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C3 Spacer。
[0008]本专利技术还提供一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT
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RPA检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物组和探针。
[0009]上述的用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT
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RPA检测试剂盒，该试剂盒还包括2
×
缓冲液A、ddH2O、缓冲液B。
[0010]上述的用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT
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RPA检测试剂盒，该试剂盒包括2
×
缓冲液A 25μL，10μM上游引物各2μL、10μM下游引物各2μL，10μM相应的探针各0.6μL，细菌DNA模板5μL，缓冲液B 2.5μL、ddH2O。
[0011]本专利技术还提供一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT
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RPA检测方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，主要包括以下步骤：S1、提取待测样品的DNA；S2、设计并合成权利要求1所述的双重RT
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RPA引物组和权利要求2所述的双重RT
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RPA探针；S3、以提取的样品DNA为模板，进行双重RT
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RPA扩增；S4、对扩增产物进行曲线分析，确定样品中是否为鼠伤寒沙门菌或沙门菌血清型4,[5],12:i
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。
[0012]上述的一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT
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RPA检测方法，RT
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RPA扩增反应体系为：2
×
缓冲液A 25μL、10μM上游引物各2μL、10μM下游引物各2μL、10μM相应的探针各0.6μL、细菌DNA模板5μL、缓冲液B 2.5μL、ddH2O；反应程序为：预热，39 ℃，40S；扩增，39 ℃，30 S，共40个循环。
[0013]上述的双重RT
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RPA检测试剂盒和双重RT
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RPA检测方法在鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种方面的应用，其中鼠伤寒沙门菌的单相变种为沙门菌血清型4,[5],12:i
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。
[0014]本专利技术的有益效果：本专利技术以鼠伤寒沙门菌、沙门菌血清型4,[5],12:i:
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均携带的STM4495基因以及鼠伤寒沙门菌携带的fljB1,2 基因设计特异性的探针和引物组，建立起双重RT
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RPA法快速鉴定鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT
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RPA引物组，其特征在于：其核苷酸序列如下所示：4495F5：GTATTTGATTCTTTATTTGTGATAAGGGTT；4495R3：CGCCACCATAAAAAACTTGGAGAAAAAAT；H2F1：TAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACT；H2R5：TCGCACCAGCAGGCATTGTGGTTTTAGTTG。2.一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT
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RPA探针，其特征在于：其核苷酸序列如下所示：STM4495probe：TATTGAAACCTCGTACCAATATCTTTGAAA[ROX
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dT][THF][BHQ2
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dT]AATATTGTCACCGG
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C3 Spacer；H2 probe：CGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGACGG[FAM
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dT]A[THF]AG[BHQ1
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dT]AACCCTTGCGGCTG
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C3 Spacer。3.一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT
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RPA检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述的引物组和权利要求2所述的探针。4.根据权利要求3所述的用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT
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RPA检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括2
×
缓冲液A、ddH2O、缓冲液B。5.根据权利要求4所述的用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋增海，
申请(专利权)人：河南牧业经济学院，
类型：发明
国别省市：