用于定量抗体的高通量和基于质谱的方法技术

提供用于定量样品中的目标蛋白的无液相色谱方法。一个实施例提供一种用于定量样品中的目标抗体的无液相色谱方法，其包括以下步骤：用经标记的内标抗体对样品进行加标，消化样品中的抗体以产生肽，分级分离肽；以及使用含有一个或多个离子阱和两个或更多个四极质量过滤器和电喷雾离子化器的直接输注MS2系统定量目标抗体，其中所述方法是无液相色谱的。其中所述方法是无液相色谱的。其中所述方法是无液相色谱的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于定量抗体的高通量和基于质谱的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年6月9日提交的美国临时专利申请第63/036,679号的权益和优先权，该申请以全文引用的方式并入。


[0003]本专利技术大体上涉及用于定量抗体的系统和方法。
[0004]序列表
[0005]本申请含有序列表，该序列表以ASCII格式以电子方式提交并特此以全文引用的方式并入。所述ASCII副本创建于2021年6月2日，命名为064752_032PCT1_SL.txt，大小为622字节。

技术介绍

[0006]为了开发基于抗体的治疗剂，对动物血清/血浆样品中的药物分子进行可靠的定量对于支持毒理动力学和药物动力学研究至关重要。液相色谱
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串联质谱联用(LC
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MS/MS)方法已越来越多地应用于定量复杂生物基质中的治疗性肽和蛋白质，因为该方法与配体结合分析法(LBA)相比，在方法开发时间、特异性、选择性、多路可行性和宽动态范围方面具有优势。然而，常规的基于LC
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MS的分析法往往存在低通量的问题，例如，使用LC
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MS每天仅可处理100个样品。
[0007]因此，本专利技术的一个目标是提供更有效且更灵敏的用于定量样品中的人类单克隆抗体(mAb)的系统和方法。
[0008]本专利技术的另一个目标是提供每天可对超过100个样品中的蛋白质浓度进行定量的系统和方法。

技术实现思路

[0009]提供用于定量样品中的目标蛋白的无液相色谱方法。一个实施例提供一种用于定量样品中的目标抗体的无液相色谱方法，其包括以下步骤：用经标记的内标抗体对样品进行加标，消化样品中的抗体以产生肽，分级分离肽；以及使用含有一个或多个离子阱和两个或更多个四极质量过滤器和电喷雾离子化器的直接输注MS2系统定量目标抗体，其中该方法是无液相色谱的。在一些实施例中，该方法进一步包括在分级分离之前用经标记的Fc肽VVSVLTVLHQDWLNGK(SEQ ID NO:1)对肽进行加标的步骤。在一个实施例中，肽是通过反相固相萃取来分级分离。经标记的内标抗体和经标记的Fc肽通常用重同位素标记。在一些实施例中，重同位素选自由
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C、
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N和2H组成的群组。在一个实施例中，目标抗体是人类单克隆抗体。
[0010]另一个实施例提供一种定量生物样品中的蛋白质药品的方法，其包括以下步骤：用已知量的具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的经重同位素标记的肽标准品对样品进行加标，将样品中的蛋白质药品消化成肽，在保留具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽的
条件下分级分离肽，使用MS2系统分析含有蛋白质药品肽和肽标准品的样品中具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽的存在来校正系统，其中MS2系统包含一个或多个离子阱和两个或更多个四极质量过滤器和电喷雾离子化器，并基于肽的存在定量样品中存在的蛋白质药品的量，其中该方法不利用液相色谱。蛋白质药品可以是抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或重组蛋白。在一些实施例中，用于定量药品离子和带质量标签的肽标准品离子的数据是在不同的MS2扫描中采集。如上文所述，使用反相固相萃取，使用15至25％乙腈作为洗涤液和20至30％乙腈洗脱液来分级分离肽。在一个实施例中，使用20％乙腈洗涤液和24％乙腈洗脱液。
[0011]在一个实施例中，该方法进一步包括在消化样品之前用经重同位素标记的蛋白质药品对蛋白质药品的样品进行加标的步骤。
[0012]在一些实施例中，样品含有血液或血清。血液或血清可以是人类或非人类的。在一个实施例中，血清是猴血清。
[0013]在一个实施例中，所公开的方法的动态范围为1至1000μm/mL且定量下限(LLOQ)为1
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2μg/mL。
[0014]在另一个实施例中，所公开的方法是自动化高通量方法。
附图说明
[0015]图1是本文所公开的示例性方法的工作流程的示意图。
[0016]图2A
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2C是显示本文所公开的示例性方法的工作流程的图。
[0017]图3A
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3F是显示内源性和内标(IST)肽的顺序平行反应监测(PRM)采集的示例性图。
[0018]图4A
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4C是显示PRM的内源性和IST肽的宽范围共分离的示例性图。
[0019]图5A
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5E是显示2路PRM采集的示例性图。
[0020]图6A是使用宽分离PRM在1μg/mL下采集的内源性和加标肽y14++的质谱图。图6B是使用2路PRM在1μg/mL下采集的内源性和加标肽y14++的质谱图。
[0021]图7A是显示图7B
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7D中测试的产物离子的表格。图7B
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7E是空白样品或10μg/mL感兴趣的mAb样品中的内源性和加标y8+和y14++产物离子的质谱。
[0022]图8A是本文所公开的示例性方法的逐步乙腈(ACN)梯度洗脱的示意图。图8B是显示跨ACN逐步梯度的VVSV肽分布百分比的图。图8C是显示使用不同ACN洗脱窗口(18％洗涤，24％洗脱；18％洗涤，26％洗脱；20％洗涤，24％洗脱；20％洗涤，26％洗脱)的VVSV肽强度的图。
[0023]图9A
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9B是质谱图，显示用18％ACN洗涤并用24％ACN洗脱的Oasis SPE板(图9A)和用20％ACN洗涤并用24％ACN洗脱的Strata X
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SPE板中y14++产物离子的相对丰度。
[0024]图10A
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10B是校准曲线，显示不同浓度的重肽的重肽信号强度。将数据拟合为具有1/x加权的线性回归模型。
[0025]图11A
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11B是校准曲线，显示加标重mAb内标的样品在不同蛋白质浓度下的标准化反应。数据是使用具有1/x加权的线性回归模型拟合。
[0026]图12是显示使用所公开的方法检测抗体浓度的QC样品分析的表格。
[0027]图13A
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13B是质谱图，显示血清空白(图13A)和血清+内标mAb(图13B)中内源性和
SIL肽的相对丰度。
[0028]图14是显示使用不同批次的猴血清测定LLOQ的表格。
[0029]图15A
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15B是校准曲线，显示猴血清中不同浓度的mAb1的相对反应(图15A)和强度(图15B)。图15C是显示QC样品分析结果的表格。
[0030]图16是显示增加的洗涤体积提高LLOQ的条形图。X轴代表洗涤体积而Y轴代表1μg/mL mAb的反应/空白。
具体实施方式
[0031]I.定义
[0032]应了解，本公开不限于本文所述的组合物和方法以及所述的实验条件，因而可变化。还应理解，本文所用的术语仅出于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于定量样品中的目标抗体的无液相色谱方法，其包含：用经标记的内标抗体对所述样品进行加标；消化所述样品中的所述抗体以产生肽；分级分离所述肽；以及使用含有一个或多个离子阱和两个或更多个四极质量过滤器和电喷雾离子化器的直接输注MS2系统定量所述目标抗体，其中所述方法是无液相色谱的。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含在分级分离之前用经标记、带标签的Fc肽VVSVLTVLHQDWLNGK(SEQ ID NO:1)对所述肽进行加标的步骤。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述肽是通过固相萃取来分级分离。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述固相萃取是反相固相萃取。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中经标记的内标抗体和所述带质量标签的Fc肽用重同位素标记。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述重同位素选自由
13
C、
15
N和2H组成的群组。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述目标抗体是人类单克隆抗体。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述质谱系统是串联质谱系统。9.一种定量生物样品中的蛋白质药品的方法，其包含：用已知量的具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的带重质量标签的肽标准品对所述样品进行加标；将所述样品中的蛋白质药品消化成肽；在保留具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽的条件下分级分离所述肽；使用MS2系统分析含有所述蛋白质药品肽和...

【专利技术属性】
技术研发人员：严悦恬，王顺海，
申请(专利权)人：里珍纳龙药品有限公司，
类型：发明
国别省市：