Hnf4a点突变的细胞模型及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术技术领域，尤其是涉及一种Hnf4a点突变(487C>T)的Hela细胞模型及其构建方法和应用，其中，构建方法包括以下步骤：针对Hnf4a基因需要突变的目的基因位点，设计gRNA靶点；根据gRNA靶点合成插入片段，并构建敲除质粒；将敲除质粒转染至Hela细胞，并同时加入donor质粒，得到Hnf4a基因突变的Hela细胞模型。经活性检测及测序鉴定得到的Hnf4a点突变的Hela细胞模型，为一稳定可靠的模型，可用于由Hnf4a点突变所致的单基因糖尿病的诊断和精确分型，进而实现个体化治疗，给予患者最优化治疗方案的基础，对于疾病进程、预后的判断及对家族遗传指导具有重要的意义。及对家族遗传指导具有重要的意义。及对家族遗传指导具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
Hnf4a点突变的细胞模型及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物技术
，尤其是涉及一种Hnf4a点突变(487C>T)的Hela细胞模型及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]糖尿病是一种受遗传和环境等因素影响的慢性代谢性疾病，糖尿病及其并发症给我国的经济发展和人民健康带来沉重负担。
[0003]在糖尿病患者中，约1
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4％的患者为单基因糖尿病，这类患者的糖尿病是由单个基因异常改变而引起胰岛β细胞功能失常所致，且单基因糖尿病的发生几乎不受环境的影响。单基因糖尿病主要包括新生儿糖尿病(NDM)和青少年发病的成人型糖尿病(MODY)。青少年发病的成人型糖尿病是一组常染色体显性遗传病，MODY家系中携带突变基因的健康成员的患病风险高达95％，且同一家系的患者临床表现高度相似。
[0004]在欧洲，MODY占总糖尿病人群的1％
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2％。内分泌学界认为，至少有6种不同基因中的一种突变导致了MODY，包括编码葡萄糖激酶(glucokinase，GCK)的基因(MODY2)和编码5个转录因子的基因：肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor，HNF
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4A(MODY1)、HNF
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1A(MODY3)、胰岛素启动因子1(insulin promoter factor，IPF
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1)(MODY4)、HNF
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1B(MODY5)以及神经元性分化因子1(neuronal differentiation 1，NEUROD1)(MODY6)。
[0005]其中，MODY1型是由Hnf4a突变所致，Hnf4a主要表达于肝脏，但在胰腺和肾脏上也有表达，该基因编码的转录因子通过多种途径影响糖代谢，MODY1患者往往可出现巨大儿和儿童高胰岛素血症，且其甘油三脂的水平较低。因此，对由Hnf4a突变所致的单基因糖尿病的诊断和精确分型是实现个体化治疗，给予患者最优化治疗方案的基础，并且对于疾病进程、预后的判断及对家族遗传指导具有重要的意义。
[0006]本专利技术致力于提供一种可用于单基因糖尿病的诊断和精确分型的Hnf4a点突变(487C>T)的Hela细胞模型以及其构建方法和应用。

技术实现思路

[0007]本专利技术的第一目的在于提供一种Hnf4a点突变的Hela细胞模型的构建方法，该构建方法操作简单便捷，所得细胞模型稳定可靠；
[0008]本专利技术的第二目的在于提供一种Hnf4a点突变的Hela细胞模型，可用于由Hnf4a点突变所致的单基因糖尿病的诊断和精确分型。
[0009]本专利技术提供一种Hnf4a点突变的Hela细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
[0010]S1、针对Hnf4a基因需要突变的目的基因位点，设计gRNA靶点；
[0011]S2、根据gRNA靶点合成插入片段，并构建敲除质粒；
[0012]S3、将敲除质粒转染至Hela细胞，并同时加入donor质粒，得到Hnf4a基因突变的Hela细胞模型；
[0013]其中，所述gRNA靶点的序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示；
[0014]所述donor的序列如SEQ ID No.3。
[0015]本专利技术中Hnf4a的部分序列如SEQ ID No.10所示，而本专利技术中所指的Hnf4a点突变具体指将487位的C突变为T，即487C>T。
[0016]作为本技术方案优选地，步骤S2中，所述gRNA靶点对应的正向引物的序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示，所述gRNA靶点对应的反向引物的序列如SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示。
[0017]当gRNA靶点的序列如SEQ ID No.1所示时，对应的正向引物的序列如SEQ ID No.4所示，反向引物的序列如SEQ ID No.6所示；当gRNA靶点的序列如SEQ ID No.2所示时，对应的正向引物的序列如SEQ ID No.5所示，反向引物的序列如SEQ ID No.7所示。上述两种gRNA靶点用于构建敲除质粒，进而用于细胞模型的构建，均有一定的内源性，并以SEQ ID No.2所示的gRNA靶点内源活性最高。
[0018]作为本技术方案优选地，步骤S2中，所述插入片段具体包括：利用所述正向引物和所述反向引物合成的引物合成引物二聚体。
[0019]作为本技术方案优选地，步骤S2中，所述构建敲除质粒具体包括：使用DNA ligase将酶切好的pU6
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gRNA
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cas9质粒与引物二聚体连接起来，得到敲除质粒。
[0020]作为本技术方案优选地，步骤S3之后还包括步骤S4：转染敲除质粒的Hela细胞的活性检测和单克隆细胞的目的位点基因鉴定。
[0021]作为本技术方案优选地，所述活性检测时，提取转染敲除质粒Hela细胞的基因组，以基因组DNA为模板，采用正向引物Hnf4a
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F1和反向引物Hnf4a
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R1进行扩增，回收产物后进行活性检测；
[0022]所述正向引物Hnf4a
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F1的序列如SEQ ID No.8所示；
[0023]所述反向引物Hnf4a
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R1的序列如SEQ ID No.9所示。
[0024]作为本技术方案优选地，所述目的位点基因鉴定时，使用所述正向引物Hnf4a
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F1和所述反向引物Hnf4a
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R1对单克隆细胞基因组DNA进行PCR扩增，回收产物后进行一代测序。
[0025]根据上述构建方法构建得到的Hnf4a点突变的Hela细胞模型也理应属于本专利技术的保护范围。
[0026]本专利技术还公开了上述Hnf4a点突变的Hela细胞模型在由Hnf4a点突变所致糖尿病的机理研究、药物筛选以及防治产品中的应用，其产品包括试剂、试剂盒、药物或保健品，但不限于此。
[0027]本专利技术Hnf4a点突变的Hela细胞模型的构建方法，至少具有以下技术效果：
[0028]本专利技术首先根据由Hnf4a点突变需要突变的位点，设计了特异性的gRNA靶点，合成表达gRNA的质粒，然后在此基础上，根据gRNA靶点合成插入片段，构建敲除质粒，并同时引入donor序列，建立Hnf4a点突变的Hela细胞模型。经活性检测及测序鉴定得到的Hnf4a点突变的Hela细胞模型，为一稳定可靠的模型，可用于由Hnf4a点突变所致的单基因糖尿病的诊断和精确分型，进而实现个体化治疗，给予患者最优化治疗方案的基础，对于疾病进程、预后的判断及对家族遗传指导具有重要的意义。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Hnf4a点突变的Hela细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、针对Hnf4a基因需要突变的目的基因位点，设计gRNA靶点；S2、根据gRNA靶点合成插入片段，并构建敲除质粒；S3、将敲除质粒转染至Hela细胞，并同时加入donor质粒，得到Hnf4a基因突变的Hela细胞模型；其中，所述gRNA靶点的序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示；所述donor的序列如SEQ ID No.3所示。2.根据权利要求1所述的Hnf4a点突变的Hela细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤S2中，所述gRNA靶点对应的正向引物的序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示，所述gRNA靶点对应的反向引物的序列如SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示。3.根据权利要求2所述的Hnf4a点突变的Hela细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤S2中，所述插入片段具体包括：利用所述正向引物和所述反向引物合成的引物合成引物二聚体。4.根据权利要求3所述的Hnf4a点突变的Hela细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤S2中，所述构建敲除质粒具体包括：使用DNA ligase将酶切好的pU6
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gRNA
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cas9质粒与引物二聚体连接起来，得到敲除质粒。5.根据权利要求1所述的Hnf4a点突变的Hela细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤S3之后还包括步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊高威，王清涛，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京朝阳医院，
类型：发明
国别省市：