一种准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法技术

本发明专利技术提供一种准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法，包括：获取一系列浓度荧光物质溶液的荧光光谱和吸光度光谱；对所有光谱进行预处理，并设置校正荧光衰减吸收程度系数的考察范围和光谱畸变度的考察段；根据次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型，利用吸光度光谱校正在考察范围内所有浓度下的荧光光谱，得到不同n值下校正后的荧光光谱；计算在考察范围内各浓度荧光光谱的畸变度；根据全浓度范围内的最小畸变度，确定此时的校正荧光吸收程度系数，即为n

【技术实现步骤摘要】
一种准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法


[0001]本专利技术涉及定量分析
，具体地，涉及一种准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法。

技术介绍

[0002]荧光光谱法具有灵敏度高、准确度高、检出限低、选择性好、无损、简便等优点，是最常用、最可靠的分析方法之一。它提供了有关物质的分子相互作用、能级转换和浓度变化的丰富信息，广泛应用于生化分析、材料应用、临床医学检测、环境监测、食品安全、公安情报等领域。
[0003]荧光光谱法是依据荧光强度与物质浓度的关系建立的。在测量低浓度的荧光溶液时，检测到的溶液荧光强度F
obs
与荧光物质溶液的浓度c成正比。随着溶液浓度的进一步增大，将会出现荧光强度不随溶液浓度线性增大，甚至随着浓度的增大而下降的现象，导致荧光强度与浓度之间线性关系的偏离，甚至造成光谱形状的畸变。若根据此时的荧光强度和线性关系系数反推浓度，其预测的浓度值将会造成很大偏差。这一现象可以用荧光的内滤效应来解释。其一是初级内滤效应(pIFE)，当溶液浓度过高时，入射光被样品池前部荧光物质吸收后会强烈，导致实际用于激发的光强减弱，进而造成荧光强度下降。其二是次级内滤效应(sIFE)，通常出现在吸收光谱和荧光发射光谱有较大重叠的荧光溶液中，吸收光谱和荧光发射光谱的重叠使得发射的荧光被样品重新吸收。
[0004]由于存在荧光内滤效应(IFE)，采用常规的荧光光谱分析法不能精确的定量物质浓度，已有研究将荧光内滤效应看成荧光分析中的一个误差源，导致荧光光谱失真、光谱形状畸变以及荧光信号强度和荧光团浓度之间呈现非线性，许多研究人员试图通过推导IFE校正公式来恢复荧光强度与其浓度之间的线性关系。一些研究人员利用吸光度对荧光强度和荧光物质溶液的浓度的公式进行了修正，修正后公式为：
[0005][0006]其中，F
obs
为测得的最大荧光强度，F
corr
是从F
obs
中校正内滤效应后的最大荧光强度；A
ex
和A
em
分别表示激发波长和发射波长处的吸光度；s是激发光束的厚度，g是激发光束边缘与比色皿边缘(接收端方向)之间的距离，d是比色皿的宽度。
[0007]1994年，Albinsson等人给出了校正后的荧光强度约为
[0008][0009]Nettles等人对一系列参考样品中的水拉曼信号的测量，得到样品中由内滤效应造成的拉曼强度变化，并通过水拉曼强度和吸光度等量的关系做简单的线性拟合，确定荧光光度计的有效激发路径长度d
ex
和发射路径长度d
em
，再利用公式(3)更加可靠地校正荧光和拉曼内滤效应，其中L是用于测量样品吸收光谱所用的比色皿宽度。
[0010][0011]Ma等人研究了罗丹明6G水溶液的荧光激发光谱随浓度变化的sIFE并提出了一个数学模型来解sIFE引起的荧光激发光谱拐点。
[0012]上述这些研究的校正公式大多针对比色皿几何结构与光束的几何参数对内滤效应进行校正，没有考虑荧光物质本身的溶质溶剂系统对内滤效应的影响，也没有考虑到发生sIFE的荧光物质，随着溶液浓度的增加，会形成二聚体或多聚体。二聚体或多聚体对荧光光谱和吸光度光谱的贡献程度不同，对发射荧光的被吸收过程的影响程度也是不同的，传统的校正吸收过程的方式并不能满足校正需求，对荧光光谱强度衰减和荧光峰的红移等问题的校正还有待完善。因此，利用吸光度对荧光强度进行修正后的荧光强度公式仍然不能用于具有sIFE的荧光溶液的测量和定量分析。

技术实现思路

[0013]针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供一种准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法，以解决具有次级内滤效应的荧光物质光谱校正及定量的难题。
[0014]根据本专利技术的一个方面，提供一种准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法，该方法包括：
[0015]获取一系列浓度荧光物质溶液的荧光光谱和吸光度光谱；
[0016]对所述荧光光谱和所述吸光度光谱进行预处理，并设置校正荧光衰减吸收程度系数n的考察范围和光谱畸变度的考察段；
[0017]根据次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型，利用吸光度光谱校正在n的考察范围内所有浓度下的荧光光谱，得到校正后不同n值下所有浓度的荧光溶液的的荧光光谱；
[0018]计算在n的考察范围内各浓度荧光光谱的畸变度；
[0019]根据全浓度范围内的最小畸变度，确定此时的校正荧光吸收程度系数n，即为该荧光物质的次级内滤效应荧光衰减吸收指数n
opt
；
[0020]利用吸光度光谱计算所有浓度下的当n＝n
opt
时的荧光光谱，得到基于n
opt
校正后的荧光光谱。
[0021]根据基于n
opt
校正后的荧光光谱，得到待测溶液的浓度；具体地，在测量过程中，n＝n
opt
时的校正后荧光光谱为建模和预测阶段均需要处理获得的光谱。建模阶段，各浓度溶液进行上述步骤的处理，得到建模的基于n
opt
校正的荧光光谱，并与荧光溶液的浓度值建立“荧光强度
‑
浓度”线性关系；预测阶段，未知浓度的溶液进行上述步骤的处理，得到该溶液的基于n
opt
校正的荧光光谱，并根据上述的“荧光强度
‑
浓度”线性关系，得到待测溶液的浓度，实现精度更高的荧光溶液浓度测量。
[0022]进一步地，所述设置校正荧光衰减吸收程度系数n的考察范围和光谱畸变度的考察段，其中：光谱畸变度的考察段为吸光度光谱与荧光光谱产生交叠的部分所在波长段。
[0023]进一步地，所述设置校正荧光衰减吸收程度系数n的考察范围和光谱畸变度的考察段，其中：考察范围根据畸变度的最低点设置，考察范围覆盖畸变度的最低点。
[0024]进一步地，所述根据次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型，其中，次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型为：
[0025][0026]n
opt
表示次级内滤效应荧光衰减吸收指数，A
em
表示发射波长处的吸光度，d
em
表示发射路径长度，L表示激发路径长度和发射路径长度之和，F
obs
表示测得的荧光强度，F
oorr
表示从F
obs
中校正内滤效应后的最大荧光强度。
[0027]更进一步地，所述根据次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型，其中：次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型的确定过程包括：
[0028]基于利用吸光度对荧光强度进行修正后的荧光强度公式，在发射荧光吸光度前添加一个校正吸收的系数来表征需要校正的吸收程度，对应的公式I为：
[0029][0030]其中，F
obs
表示测得的荧光强度，F
corr
表示从F
obs
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法，其特征在于，包括：获取一系列浓度荧光物质溶液的荧光光谱和吸光度光谱；对所述荧光光谱和所述吸光度光谱进行预处理，并设置校正荧光衰减吸收程度系数n的考察范围和光谱畸变度的考察段；根据次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型，利用吸光度光谱校正在n的考察范围内所有浓度下的荧光光谱，得到校正后的不同n值下所有浓度的荧光溶液的荧光光谱；计算在n的考察范围内各浓度荧光光谱的畸变度；根据全浓度范围内的最小畸变度，确定此时的校正荧光吸收程度系数n，即为该荧光物质的次级内滤效应荧光衰减吸收指数n
opt
；利用吸光度光谱计算所有浓度下的当n＝n
opt
时的荧光光谱，得到基于n
opt
校正后的荧光光谱；根据基于n
opt
校正后的荧光光谱，得到待测溶液的浓度。2.根据权利要求1所述的准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法，其特征在于，所述设置校正荧光衰减吸收程度系数n的考察范围和光谱畸变度的考察段，其中：光谱畸变度的考察段为吸光度光谱与荧光光谱产生交叠的部分所在波长段。3.根据权利要求1所述的准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法，其特征在于，所述设置校正荧光衰减吸收程度系数n的考察范围和光谱畸变度的考察段，其中：考察范围根据畸变度的最低点设置，考察范围覆盖畸变度的最低点。4.根据权利要求1所述的准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法，其特征在于，所述根据次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型，其中，次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型为：n
opt
表示次级内滤效应荧光衰减吸收指数，A
em
表示发射波长处的吸光度，d
em
表示发射路径长度，L表示激发路径长度和发射路径长度之和，F
obs
表示测得的荧光强度，F
corr
表示从F
obs
中校正内滤效应后的最大荧光强度。5.根据权利要求4所述的准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘天元，李婉香，富雨超，黄梅珍，李昊宸，梁婉，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：