基于核壳发射体Ag@SiO2和淬灭剂CeO2之间电子转移的电化学发光传感器制造技术

本发明专利技术涉及一种新型核壳发射体Ag@SiO2纳米材料检测神经特异性烯醇化酶的电化学发光传感器的制备方法，属于电化学发光传感器领域。本发明专利技术以二氧化硅包裹的银纳米粒子作为电化学发光体，以氨基功能化的八面体CeO2作为猝灭剂与检测抗体相结合，由于能级发生匹配，提供了电子转移的条件，猝灭现象得以发生，并采用“信号关闭”策略，构建了信号猝灭型ECL传感器，实现了在100 fg

【技术实现步骤摘要】
基于核壳发射体Ag@SiO2和淬灭剂CeO2之间电子转移的电化学发光传感器


[0001]本专利技术涉及一种基于核壳发射体Ag@SiO2和淬灭剂CeO2之间电子转移的电化学发光传感器的制备方法。具体是采用核壳结构的二氧化硅包覆银纳米粒子作为传感平台和电致化学发光（ECL）发射体，将八面体二氧化铈作为猝灭剂连接在抗体上，依据电子转移策略，制备了一种检测神经特异性烯醇化酶的信号猝灭型电化学发光传感器，属于电化学发光传感器领域。

技术介绍

[0002]肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，死亡率极高。此外，神经元特异性烯醇化酶(neural
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specific enolase, NSE)是一种存在于神经元和神经内分泌细胞中的糖酵解酶，是诊断小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)的重要指标。实际数据表明，血清NSE正常值为15.7 ~ 17.0 ng/mL(95%置信区间)，其较高水平肯定表明肿瘤的存在。因此，开发敏感、特异性检测血液和血清中NSE的新方法具有重要意义。目前检测神经特异性烯醇化酶的分析方法主要有放射免疫检定法和电化学免疫分析法，但是这两种方法操作步骤复杂，检测灵敏度低。为了克服以上传统分析方法的弊端，本专利技术提出了一种操作简单快速、灵敏度高的电化学发光免疫传感器用于神经特异性烯醇化酶的检测。
[0003]电化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）结合了电化学电位可控和化学发光高灵敏度的特点，已经发展成为一种极具应用潜力的分析方法。金属纳米颗粒(NPs)由于其固有的良好的生物相容性和低毒性而突出。此外，贵金属NPs，包括金(Au)、银(Ag)、铂(Pt)和钯(Pd)，具有表面效应和量子尺寸效应，具有良好的光、电、磁和催化性能。目前，贵金属NPs因其优异的生物相容性和荧光发射特性引起了生物传感和分析化学领域的关注。本专利技术合成了银纳米颗粒并在其表面包裹二氧化硅外壳（Ag@SiO2），SiO2具有良好的生物相容性、表面改性容易、稳定性好等优点，是一种不可或缺的包壳材料，可为发光材料提供良好的保护。包覆SiO2的复合材料已被应用于生物分析和催化等多个领域。SiO2壳层保护能有效减缓金属Ag NPs的氧化，使Ag NPs获得更稳定的ECL发射信号。同时，壳层的封装可以防止NPs的聚集。在这里，得到的Ag@SiO2新材料具有优异的ECL稳定性和高效的ECL信号。此外二氧化铈(CeO2)具有比表面积大、反应性好、化学生物相容性好等特点，为构建免疫传感器提供了有利条件。本文采用水热法制备了八面体立方晶体CeO2，并将其应用于生物分析领域。通过对实验结果的检验，本工作发现，当合理的能级匹配时，满足了电子转移的可能性，导致加入CeO2时ECL信号发生猝灭。因此，提出了以Ag@SiO2作为ECL发射器，CeO2作为ECL猝灭剂的电子转移策略，构建了信号猝灭型ECL免疫传感器。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的之一是合成尺寸约为30nm的银纳米粒子，并在其表面包裹二氧化硅(SiO2)壳。在纳米粒子合成过程中，通过调节SiO2的壳层厚度可以延缓银纳米粒子的氧化速
度，从而获得强而稳定的ECL信号。
[0005]本专利技术的目的之二是合成氨基功能化的八面体二氧化铈（CeO2）作为抗体的载体。多面体结构可以提高抗体的结合率。
[0006]本专利技术的目的之三是合成了核壳发射器Ag@SiO2作为基底材料大量地固载捕获抗体，同时其作为发光体产生高效的ECL信号，将氨基功能化的CeO2作为猝灭剂与检测抗体相结合，由于能级发生匹配，提供了电子转移的条件，猝灭现象得以发生。以神经特异性烯醇化酶抗原作为目标分析物，利用抗原
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抗体之间的免疫反应，构建信号增强型ECL免疫传感器，根据发光探针固定在电极表面前后电化学发光信号的变化，实现对神经特异性烯醇化酶抗原浓度的定量分析。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：1. 本专利技术所述的基于核壳发射体Ag@SiO2和淬灭剂CeO2之间电子转移的电化学发光传感器，所述电化学发光免疫传感器，制备步骤如下：（1）将直径为4 mm的玻碳电极用0.05 μm氧化铝粉打磨抛光至镜面，再用超纯水洗涤干净；（2）将4~6
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L 核壳型Ag@SiO2纳米材料滴涂到电极表面，室温保存至干燥；（3）继续滴6 μL、浓度为10 μg
·
mL
‑1的神经特异性烯醇化酶抗体标准溶液于玻碳电极表面，4
ꢀº
C冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；（4）继续滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液来封闭非特异性活性位点，4
ꢀº
C冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；（5）继续将6 μL、浓度为100 fg
·
mL
‑1～500 ng
·
mL
‑1的一系列不同浓度的神经特异性烯醇化酶抗原标准溶液滴涂在电极表面，4
ꢀº
C冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；（6）将5~10 μL制得的功能化CeO2与神经特异性烯醇化酶抗体Ab2的复合物CeO2‑
Ab2滴涂到电极表面，4
ꢀº
C冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测神经特异性烯醇化酶的电化学发光免疫传感器。
[0008]2. 本专利技术所述的基于核壳发射体Ag@SiO2和淬灭剂CeO2之间电子转移的电化学发光传感器的制备方法，所述核壳发射体Ag@SiO2，其制备步骤如下：（1）制备银纳米颗粒在剧烈搅拌下，10 mL的柠檬酸钠水溶液滴加到沸腾的硝酸银水溶液中，制备银胶体，煮沸一个小时，冷却到室温；离心20分钟，分散在250 mL的蒸馏水中，加入2 mL PVP水溶液，搅拌24小时，离心30分钟，用水洗离心两次，分散在10 mL水中；（2）制备二氧化硅包覆的银纳米颗粒将银纳米颗粒加到15 mL水中，再加入到225 mL异丙醇中，加入4.8 mL 25%的氢氧化铵，100~200 μL 50%的正硅酸四乙酯，室温下放置15分钟，然后放入4 ℃的冰箱中，放置12~24 h，离心后，将沉淀用无水乙醇洗涤三次后置于真空干燥箱中，60
ꢀº
C干燥后得到二氧化硅包覆的银纳米颗粒；通过控制正硅酸四乙酯含量，获得不同厚度的二氧化硅层包裹银纳米颗粒（Ag@SiO2）；（3）制备氨基功能化的纳米材料取10 mL Ag@SiO2中加入50 μL 的3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷，放置24小时，得到氨基功能化的纳米材料，用水和乙醇各自洗涤两次，真空干燥箱中60
ꢀº
C干燥。
[0009]3.本专利技术所述的基于核壳发射体Ag@SiO2和淬灭剂CeO2之间电子转移的电化学发光传感器的制备方法，所述功能化CeO2与神经特异性烯醇化酶抗体Ab2的复合物，其特征在于，制备步骤如下：（1）制备八面体二氧化铈CeO2将1 mmol Ce(NO3)3·
6H2O和0.01 mmol Na本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于核壳发射体Ag@SiO2和淬灭剂CeO2之间电子转移的电化学发光传感器，其特征在于，电化学发光免疫传感器的制备包括以下步骤：（1）将直径为4 mm的玻碳电极用0.05 μm氧化铝粉打磨抛光至镜面，再用超纯水洗涤干净；（2）将4~6
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L核壳型Ag@SiO2纳米材料滴涂到电极表面，室温保存至干燥；（3）继续滴6 μL、浓度为10 μg
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‑1的神经特异性烯醇化酶抗体标准溶液于玻碳电极表面，4
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C冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；（4）继续滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液来封闭非特异性活性位点，4
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C冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；（5）继续将6 μL、浓度为100 fg
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‑1～500 ng
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‑1的一系列不同浓度的神经特异性烯醇化酶抗原标准溶液滴涂在电极表面，4
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C冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；（6）利用水热合成的八面体CeO2进行氨基功能化，将5~10 μL制得的功能化CeO2与神经特异性烯醇化酶抗体Ab2的复合物CeO2‑
Ab2滴涂到电极表面，4
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C冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测神经特异性烯醇化酶的电化学发光免疫传感器。2.如权利要求1所述的基于核壳发射体Ag@SiO2和淬灭剂CeO2之间电子转移的电化学发光传感器的制备方法，所述核壳发射体Ag@SiO2，其制备步骤如下：（1）制备银纳米颗粒在剧烈搅拌下，10 mL的柠檬酸钠水溶液滴加到沸腾的硝酸银水溶液中，制备银胶体，煮沸一个小时，冷却到室温；离心20分钟，分散在250 mL的蒸馏水中，加入2 mL PVP水溶液，搅拌24小时，离心30分钟，用水洗离心两次，分散在10 mL水中；（2）制备二氧化硅包覆的银纳米颗粒将银纳米颗粒加到15 mL水中，再加入到225 mL异丙醇中，加入4.8 mL 25%的氢氧化铵，100 μL 50%的正硅酸四乙酯，室温下放置15分钟，然后放入4 ℃的冰箱中，放置24 h，离心后，将沉淀用无水乙醇洗涤三次后置于真空干燥箱中，60
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C干燥后得到二氧化硅包覆的银纳米颗粒；通过控制正硅酸四乙酯含量，获得不同厚度的二氧化硅层包裹银纳米颗粒（Ag@SiO2）；（3）制备氨基功能化的纳米材料取10 mL Ag@SiO2中加入50 μL 的3
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氨丙基三乙氧基硅烷，放置24小时，得到氨基功能化的纳米材料，用水和乙醇各自洗涤两次，真空干燥箱中60
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C干燥。3.如权利要求1所述的基于核壳发射体Ag@SiO2和淬灭剂CeO2之间电子转移的电化学发光传感器的制备方法，所述功能化CeO2与神经特异性烯醇化酶抗体Ab2的复合物...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘家骏，鞠熀先，东雪，赖娴，魏琴，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：