用于检测PEDV的免疫生物传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种用于检测PEDV的免疫生物传感器及其制备方法和应用，涉及病原快速检测领域。该免疫生物传感器包括电极基材、氧化石墨烯层、壳聚糖层、猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层；氧化石墨烯层、壳聚糖层、猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层依次层叠覆盖于电极基材。该免疫生物传感器针对PEDV的检测具有优异的灵敏性、精确性和特异性。精确性和特异性。精确性和特异性。

【技术实现步骤摘要】
用于检测PEDV的免疫生物传感器及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及病原快速检测领域，特别是涉及一种用于检测PEDV的免疫生物传感器及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)是PED的主要病原体，是一种有囊膜的RNA病毒，属于冠状病毒科、α冠状病毒属的成员。PEDV可感染许多年龄段的猪，但主要引起新生仔猪出现腹泻、呕吐、厌食、脱水和体重减轻等症状，7日龄以下仔猪病死率甚至可达100%。PEDV于1978年由Pensaert等于比利时首次分离，随后传播至许多国家及地区，并造成了严重经济损失，目前对于PEDV主要的防控手段为接种疫苗，由于缺乏相应的治疗药物，因此，及时地检测PEDV是防控该病的前提和基础。建立一种快速、准确、易操作、成本低廉的检测方法将有利于在生产实践中及早诊断和控制该病的流行。
[0003]目前，目前用于PEDV的检测的方法主要包括病毒分离鉴定、实时荧光定量PCR（Quantitative Real
‑
time PCR，qPCR）、酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）等。
[0004]病毒分离鉴定是最为准确、可靠的病毒检测方法，是病毒检测的“金标准”，也是最早出现的病毒检测方法。该方法首先采集病料，并使用细胞或鸡胚进行病毒培养分离，随后对病毒进行毒力测定、理化性质测定等以确诊病毒。该方法检测的准确率高，但检测周期长，操作繁琐、成本高昂，且对操作人员的素质有着较高的要求，不适用于实际生产中的大范围应用及推广。
[0005]实时荧光定量PCR（Quantitative Real
‑
time PCR，qPCR）具有灵敏性高、检测时间短等的特点，其基本原理是在体外核酸扩增过程中，加入可插入核酸序列中的荧光物质，随着扩增的不断进行，荧光物质的数量不断增加，通过荧光信号的强弱以检测病毒的数量。该方法是目前使用最广泛的方法之一，相较于聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），其进一步地提高了灵敏性，高效且省时，但其检测设备及试剂较为昂贵，且容易污染出现假阳性的结果，对操作人员的素质要求高。
[0006]酶联免疫吸附试验（Enzyme
‑
linked Immunosorbent Assay，ELISA）具有操作简便、试验条件要求较低的特点，而被广泛应用于数量较多的样品的检测。其基本原理是利用抗原抗体的特异性结合，预先在固相载体上固定抗原，或抗体，在抗原抗体结合后通过肉眼观察沉淀或使用酶标仪来判定检测结果。ELISA相较于qPCR等的分子生物学诊断方法成本较低，对于试验条件要求较低，操作简单。但其检测的灵敏度较差，孵育时间长等缺点。

技术实现思路

[0007]针对上述技术问题，本专利技术提供一种用于检测PEDV的免疫生物传感器，该免疫生物传感器针对PEDV的检测具有优异的灵敏性、精确性和特异性。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种用于检测PEDV的免疫生物传感器，该免疫
生物传感器包括电极基材、氧化石墨烯层、壳聚糖层、猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层；所述氧化石墨烯层、所述壳聚糖层、所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层依次层叠覆盖于所述电极基材。
[0009]免疫生物传感器具有制备成本低、操作简单等特点，仅需简单的培训后即可使用，更适用于实际生产中的应用。因此，本专利技术人为利用抗原抗体特异性结合的特点，对PEDV进行检测，在工作电极上固定修饰材料以提高传感器检测性能，随后在工作电极上固定抗体，通过抗原抗体结合后传感器检测的电流变化以进行检测。
[0010]不仅如此，本专利技术人采用氧化石墨烯/壳聚糖作为电极的修饰材料。石墨烯（Graphene，GR）由于其具有比表面积大、热导率高、力学性能好和电荷迁移率高等优异的物理化学性质，从而在电化学催化、电化学分析等领域已得到了广泛的关注。但由于GR会发生不可逆的团聚现象，从而限制使其在电化学各领域的应用。氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）是GR的一种重要衍生物，也可看作是一种典型的功能化GR，其结构与GR非常相似，而GO制备简单、易得，且具有良好的亲水特性，可弥补GR的不足。
[0011]壳聚糖（Chitosan，CS）具有来源丰富、价格便宜、无毒性、良好的生物相容性、生物降解性及抗菌性能等特点。在其分子链中含有的大量氨基，可通过pH的变化发生溶胶
‑
凝胶转变，使其在阴极表面通过自组装成为水凝胶，当施加一定电压或电流时，在电极表面会发生电化学反应，在阴极处由于水的电化学反应产生OH
−
或消耗H
+
，导致阴极表面产生局部较高的pH梯度，溶液中阴极附近的CS分子由于阴极表面产生的局部高pH而发生溶胶
‑
凝胶转变，在阴极表面形成CS凝胶。
[0012]在其中一个实施例中，所述电极基材为玻碳电极。
[0013]本领域常用的电化学电极主要有圆盘电极（玻碳电极、金电极、铂电极）、氧化铟锡电极（ITO电极）、丝网印刷电极（丝网印刷碳电极、丝网印刷金电极、丝网印刷镍电极等）以及叉指阵列微电极等。而本专利技术人选择的玻碳电极（Glassy Carbon Electrode, GCE）具有较好的导电性，较高的化学稳定性，且热胀系数小、质地坚硬、气密性好，其可制成圆柱、圆盘等电极形状，用它作基体还可制成汞膜玻碳电极和化学修饰电极等。本专利技术中采用GCE作为传感器的工作电极，可较好的提高传感器的灵敏性，且GCE性状稳定、便于储存，相较于其他类型的工作电极，其价格相对低廉，使用广泛。
[0014]在其中一个实施例中，所述免疫生物传感器还包括：覆盖于所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层表面的牛血清蛋白封闭层。
[0015]通过利用牛血清蛋白溶液封闭电极上多余的非特异性活性位点，使该免疫生物传感器具有较好的特异性。
[0016]本专利技术还提供了一种用于检测PEDV的免疫生物传感器的制备方法，包括以下步骤：制备氧化石墨烯层：通过电化学还原法使氧化石墨烯沉积于电极基材表面，形成氧化石墨烯层；制备壳聚糖层：通过电化学沉积法使壳聚糖沉积于所述氧化石墨烯层表面，形成壳聚糖层；制备猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层：将猪流行性腹泻病毒单克隆抗体滴涂至壳聚糖层表面，孵育，形成猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层，得到用于检测PEDV的免疫生物传
感器。
[0017]现有技术中，将氧化石墨烯（GO）固定至电极上的方法，通常采用滴涂法，即将制备好的GO或功能化GO，如还原型氧化石墨烯（Reduced Graphene Oxide, rGO），滴涂至电极表面，待其干燥后即完成对电极的修饰，该法操作简单，但其需较长的干燥时间，且无法精确控制电极表面的石墨烯层数。不仅如此，氧化石墨烯（GO）结构中富含的各种含氧基团会导致G本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测PEDV的免疫生物传感器，其特征在于，该免疫生物传感器包括电极基材、氧化石墨烯层、壳聚糖层、猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层；所述氧化石墨烯层、所述壳聚糖层、所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层依次层叠覆盖于所述电极基材。2.根据权利要求1所述的用于检测PEDV的免疫生物传感器，其特征在于，所述电极基材为玻碳电极。3.根据权利要求1
‑
2中任一项所述的用于检测PEDV的免疫生物传感器，其特征在于，所述免疫生物传感器还包括：覆盖于所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层表面的牛血清蛋白封闭层。4.一种用于检测PEDV的免疫生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备氧化石墨烯层：通过电化学还原法使氧化石墨烯沉积于电极基材表面，形成氧化石墨烯层；制备壳聚糖层：通过电化学沉积法使壳聚糖沉积于所述氧化石墨烯层表面，形成壳聚糖层；制备猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层：将猪流行性腹泻病毒单克隆抗体滴涂至壳聚糖层表面，孵育，形成猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层，得到用于检测PEDV的免疫生物传感器。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层步骤还包括：滴涂流行性腹泻病毒单克隆抗体之前，将电极基材在N
‑
羟基琥珀酰亚胺和1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的混合溶液中浸泡40
‑
60min。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：制备猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层步骤后，将修饰了猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层的电极基材与牛血清蛋白孵育，形成牛血清蛋白封闭层。7.根据权利要求4<...

【专利技术属性】
技术研发人员：李智丽，罗宇杭，郭锦玥，温锋，池仕红，马广邈，黄宗洋，苏朗驹，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：