一种基于CRISPR技术检测非洲猪瘟病毒的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR技术检测非洲猪瘟病毒的方法，具体地，提供了一种基于CRISPR技术检测非洲猪瘟病毒或非洲猪瘟的方法，所述方法包括利用gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器进行检测的步骤；本发明专利技术通过对gRNA的筛选和优化，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR技术检测非洲猪瘟病毒的方法


[0001]本专利技术涉及核酸检测领域，涉及一种基于CRISPR技术检测非洲猪瘟病毒的方法，尤其涉及基于CRISPR技术检测非洲猪瘟病毒的方法、系统和试剂盒。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African Swine Fever)，是由非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)而引起的一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室监测确诊。
[0003]非洲猪瘟的实验室诊断方法有：红细胞吸附试验，直接免疫荧光试验，间接免疫荧光试验，酶联免疫吸附试验，免疫电泳试验，间接酶联免疫蚀斑试验等。目前已经有采用Cas酶检测非洲猪瘟病毒的方法，如中国专利申请CN110453011A、CN112522444A、CN110129485A、CN110106290A、CN110551846A、CN110628942A、CN110894557A、CN110951920A、CN111235232A、CN111647605A等等。我们可以看到，这些专利均是采用Cpf1进行的核酸检测；另外，在核酸检测中，即使是与同一序列杂交的不同gRNA，其检测效率差异较大，检测效果是不可预期的(参照CN110453011A实施例3)。因此，检测效率高、特异性强的gRNA对于Cas酶核酸检测至关重要。
[0004]本专利技术提供了一种新型的检测非洲猪瘟病毒的方法，该方法是基于CRISPR技术，尤其是基于V型Cas酶的trans活性，提供的一种快速简便、特异性高、检测灵敏度高的检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种基于CRISPR技术进行非洲猪瘟病毒检测的方法、系统和试剂盒。
[0006]一方面，本专利技术提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒的gRNA，所述gRNA包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于非洲猪瘟病毒的核酸。
[0007]本专利技术中，所述与CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域又称为同向重复序列、骨架区或spacer序列，该区域与Cas蛋白相互作用，从而结合Cas蛋白。
[0008]在一个实施方式中，所述gRNA自5
’
端至3
’
端依次包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。
[0009]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
‑
30个碱基，并且与SEQ ID No.1
‑
4所示的任一序列或其任一反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.6
‑
16任一所示的序列；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.7、8、9、11、14、15任一所示
的序列。
[0010]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
‑
30个碱基，并且与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.6
‑
8任一所示的序列。
[0011]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
‑
30个碱基，并且与SEQ ID No.2所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.9
‑
11任一所示的序列。
[0012]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
‑
30个碱基，并且与SEQ ID No.3所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.12
‑
14任一所示的序列。
[0013]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
‑
30个碱基，并且与SEQ ID No.4所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.15
‑
16任一所示的序列。
[0014]在优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
‑
30个碱基，例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基。
[0015]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.6
‑
16任一所示的序列，并且在SEQ ID No.6
‑
16任一所示的序列的3
’
端还包括1
‑
10个碱基(优选，1、2、3、4、5、6、7、8、9个碱基)，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.1
‑
4所示的任一序列或其任一反向互补序列杂交；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.7、8、9、11、14、15任一所示的序列。
[0016]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.6
‑
8任一所示的序列，并且在SEQ ID No.6
‑
8任一所示的序列的3
’
端还包括1
‑
10个碱基(优选，1、2、3、4、5、6、7、8、9个碱基)，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交。
[0017]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.9
‑
11任一所示的序列，并且在SEQ ID No.9
‑
11任一所示的序列的3
’
端还包括1
‑
10个碱基(优选，1、2、3、4、5、6、7、8、9个碱基)，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.2所示的序列或其反向互补序列杂交。
[0018]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.12
‑
14任一所示的序列，并且在SEQ ID No.12
‑
14任一所示的序列的3
’
端还包括1
‑
10个碱基(优选，1、2、3、4、5、6、7、8、9个碱基)，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.3所示的序列或其反向互补序列杂交。
[0019]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.15
‑
16任一所示的序列，并且在SEQ ID No.15
‑
16任一所示的序列的3
’
端还包括1
‑
10个碱基(优选，1、2、3、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测非洲猪瘟病毒的gRNA，所述gRNA包括与V型Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于非洲猪瘟病毒的核酸；其特征在于，所述与靶核酸杂交的导向序列选自下组任意一种或其组合：(1)所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
‑
30个碱基，并且与SEQ ID No.1
‑
4所示的任一序列或其任一反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.6
‑
16任一所示的序列；(2)所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.6
‑
16任一所示的序列，并且在SEQ ID No.6
‑
16任一所示的序列的3
’
端还包括1
‑
10个碱基，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.1
‑
4所示的任一序列或其任一反向互补序列杂交；(3)所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.6
‑
16任一所示的序列相比，在SEQ ID No.6
‑
16任一所示的序列的3
’
端连续缺失1
‑
5个碱基；(4)所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.6
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽梅，梁亚峰，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：