一种生物法生产高含量天然小分子RNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物法生产高含量天然小分子RNA的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过诱变筛选获得一株高产核糖核酸且产量稳定的产朊假丝酵母，以添加了无机盐以及磷酸的糖蜜为培养基，发酵得到高核糖核酸含量酵母，配制酵母浆，转移到酶反应容器中，利用酵母自身的酶和加入的核糖核酸酶酶解酵母中的RNA，酶解结束后，再利用盐法、碱法或盐碱法对酵母浆中的RNA类物质进行提取，离心所得的轻相液体经过超滤膜过滤后，调节pH值使小分子RNA沉淀，干燥后得到小分子RNA成品。采用本发明专利技术的方法生产的小分子RNA来源纯天然，比合成方法生产的小分子RNA更易于吸收利用，而且成本相对较低，操作简便，易于工业化大规模的生产。产。产。

【技术实现步骤摘要】
一种生物法生产高含量天然小分子RNA的方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种生物法生产高含量天然小分子RNA的方法。

技术介绍

[0002]酵母是一种天然存在的单细胞真菌，酵母的营养价值极高，含有丰富的蛋白质、核酸、维生素和微量元素等营养物质，核酸是生命的最基本物质之一，根据化学组成不同，核酸可分为脱氧核糖核酸(以下简称DNA)和核糖核酸(以下简称RNA)。从酵母中提取的天然RNA类物质目前已广泛应用于医药、保健食品以及婴幼儿食品中。
[0003]RNA是由多种核糖核苷酸聚合而成的一种多聚核糖核苷酸，RNA种类较多，一般分子大小大约在300个核苷酸以下的RNA称为小分子RNA。小分子RNA在生命体内发挥着重要的作用，它在细胞生长和凋亡，细胞分化，基因调节，神经元的极性，胰岛素分泌，大脑形态形成，胚胎发育等过程中发挥重要作用。目前，小分子RNA多数以合成的方法进行生产，对天然小分子RNA的提取主要集中在以动物和植物为原料，利用生物发酵法大规模生产高含量天然小分子RNA的方法尚未见报道。

技术实现思路

[0004]鉴于此，本专利技术的目的是提供了一种利用生物法生产高含量天然小分子RNA的方法。本专利技术通过诱变选育获得高核糖核酸含量的产朊假丝酵母菌种(又称杰丁塞伯林德纳氏酵母)，经发酵培养后得到的酵母浆，在酶的作用下进行酶解，再经过提取，分离，干燥等后续工艺得到高含量的天然小分子RNA。
[0005]本专利技术目的是通过以下方式实现：
[0006]本专利技术提供一株产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)ZAB 01，于2022年07月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25374，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路一号院三号。
[0007]本专利技术另一方面提供一种利用上述的产朊假丝酵母ZAB 01生产小分子RNA的方法，主要包括以下步骤：
[0008](1)将产朊假丝酵母ZAB 01在种子培养基中扩培后，接种到发酵培养基中，发酵后获得高核糖核酸含量的酵母；
[0009](2)将步骤(1)获得高核糖核酸含量的酵母经过酶解反应、提取、分离和干燥，获得小分子RNA。
[0010]基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)包括以下步骤：
[0011]1)将产朊假丝酵母ZAB 01接种于液体种子培养基中，培养温度为25～35℃，通风搅拌培养6～24h，获得种子菌液；
[0012]2)将步骤1)得到的种子菌液接种至发酵培养基中，通风搅拌发酵，发酵温度为25～40℃，发酵后获得高核糖核酸含量的酵母。
[0013]基于上述技术方案，进一步地，步骤1)和步骤2)中空气流量为0.01
‑
1.5VVM，搅拌速度100～300rpm。
[0014]基于上述技术方案，进一步地，所述的液体种子培养基和发酵培养基中的碳源包括糖蜜、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、麦芽糖、果糖和D
‑
木糖。
[0015]基于上述技术方案，进一步地，所述的液体种子培养基和发酵培养基中的氮源包括蛋白胨、酵母膏、玉米浆、尿素、硝酸钾、氨水和铵盐。
[0016]基于上述技术方案，进一步地，所述的液体种子培养基和发酵培养基中的磷源包括磷酸和磷酸盐。
[0017]基于上述技术方案，进一步地，步骤2)中发酵方式为间歇发酵、半连续发酵和连续发酵中的任意一种。
[0018]基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)包括以下步骤：
[0019]1)酶解反应：将发酵后经过分离得到的酵母加水制得酵母浆，移到酶反应容器中，升温至40～60℃，保温1～96h，利用酵母自身的酶酶解酵母中的RNA，酶解反应结束后，降温至室温；
[0020]或者，将发酵后经过分离得到的酵母加水制得酵母浆，移到酶反应容器中，升温至40～60℃，保温1～96h，降温至20～40℃，加入酵母菌体0.0001～0.1wt％的核糖核酸酶，酶解1～10h，利用酵母自身的酶和加入的核糖核酸酶酶解酵母中的RNA，反应结束后，降温至室温；
[0021]2)提取：通过离心将步骤1)得到的酵母浆酶解液浓缩，使浓缩液中干物质浓度为5
‑
15％，然后利用盐法、碱法或盐碱法对酵母浆中的RNA类物质进行提取；
[0022]3)分离：离心步骤2)得到的浆液，所得的轻相液体经超滤膜过滤处理，将所得的滤过液降温至1～10℃，调节pH值至1～3，使小分子RNA沉淀；
[0023]4)干燥：除去小分子RNA沉淀中的水分，再经过干燥得到小分子RNA。
[0024]基于上述技术方案，进一步地，步骤1)中酵母浆中酵母的浓度为1
‑
20wt％。
[0025]基于上述技术方案，进一步地，步骤2)中所述盐法具体为：将浓缩液升温至80℃～95℃，加入食盐或食盐水溶液，调节NaCl的浓度为5％～15％，继续保温30min～5h，之后冷却至室温，调节pH值至中性。
[0026]基于上述技术方案，进一步地，步骤2)中所述碱法具体为：将浓缩液升温至80℃～95℃，加入NaOH或者NaOH水溶液，调节pH值为8～11，保温30min～5h，冷却至室温，调节pH值至中性；
[0027]或者，将浓缩液中加入NaOH或者NaOH水溶液，调节NaOH的浓度为0.5％～5％，降温至0～10℃，保温30min～5h，调节pH值至中性。
[0028]基于上述技术方案，进一步地，步骤2)中所述盐碱法具体为：将浓缩液升温至80℃～95℃，加入食盐或食盐水溶液，调节NaCl的浓度为1％～10％，同时加入NaOH或者NaOH水溶液，调节pH值为8～11，保温30min～5h，冷却至室温，调节pH值至中性。
[0029]基于上述技术方案，进一步地，步骤3)中所述的超滤膜过滤处理的具体过程：采用超滤机，利用不同截留分子量的超滤膜，获得不同分子量的小分子RNA，(例如利用截留分子量为10000Da或100000Da的超滤膜，获得分子量10000Da以下或100000Da以下的小分子RNA，也可分别利用截留分子量为10000Da和100000Da的超滤膜，获得分子量10000～100000Da的
小分子RNA)，运行压力：0.2MPa，温度35℃。
[0030]基于上述技术方案，进一步地，步骤2)和步骤3)中离心的转速为5000～8000rpm。
[0031]本专利技术还提供上述方法得到的小分子RNA。
[0032]本专利技术相对于现有技术具有的有益效果如下：
[0033]1.本专利技术通过诱变筛选获得一株高产核糖核酸且产量稳定的产朊假丝酵母，以添加了无机盐以及磷酸的糖蜜为培养基，发酵培养后得到核酸含量较高的酵母浆(菌体RNA含量在18％以上)，所得的酵母浆转移到酶反应容器中，利用酵母自身的酶和加入的核糖核酸酶酶解酵母细胞中的RNA，酶反应结束后，再利用盐法、碱法或盐碱法对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)ZAB 01，其特征在于，于2022年07月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25374，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路一号院三号。2.一种利用权利要求1所述的产朊假丝酵母ZAB 01生产小分子RNA的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)将产朊假丝酵母ZAB 01在种子培养基中扩培后，接种到发酵培养基中，发酵后获得高核糖核酸含量的酵母；(2)将步骤(1)获得高核糖核酸含量的酵母经过酶解反应、提取、分离和干燥，获得小分子RNA。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括以下步骤：1)将产朊假丝酵母ZAB 01接种于液体种子培养基中，培养温度为25～35℃，通风搅拌培养6～24h，获得种子菌液；2)将步骤1)得到的种子菌液接种至发酵培养基中，通风搅拌发酵，发酵温度为25～40℃，发酵后获得高核糖核酸含量的酵母。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的液体种子培养基和发酵培养基中的碳源包括糖蜜、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、麦芽糖、果糖和D
‑
木糖；所述的液体种子培养基和发酵培养基中的氮源包括蛋白胨、酵母膏、玉米浆、尿素、硝酸钾、氨水和铵盐；所述的液体种子培养基和发酵培养基中的磷源包括磷酸和磷酸盐。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中发酵方式为间歇发酵、半连续发酵和连续发酵中的任意一种。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括以下步骤：1)酶解反应：将发酵后经过分离得到的酵母加水制得酵母浆，移到酶反应容器中，升温至40～60℃，保温1～96h，利用酵母自身的酶酶解酵母中的RNA，酶解反应结束后，降温至室温；或者，将发酵后经过分离得到的酵母加水制得酵母浆，移到酶反应容器中，升温至40～60℃，保温1～96h，降温至20～40℃，加入酵母菌体...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈玉松，黄国新，李宗颖，赵昆，刘纪宏，马媛，曾铮，陈玉平，
申请(专利权)人：大连珍奥生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：