志贺氏菌-四价（Shigella4V）生物缀合物制造技术

一种包含志贺氏菌四价(4价志贺氏菌)生物缀合物的组合物。其包含与载体蛋白共价连接的福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)血清型2a、3a、6和宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)的志贺氏菌O

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】志贺氏菌
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四价(Shigella4V)生物缀合物
[0001]序列表
[0002]本申请包含一份序列表，该序列表以ASCII格式以电子方式提交，并且其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII副本创建于2021年05月13日，名称为VU66948_SL.txt，大小为81,530字节。
专利

[0003]本专利技术涉及包含志贺氏菌四价(4价志贺氏菌)生物缀合物的组合物。更具体地，本专利技术包含与载体蛋白共价连接的福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)血清型2a、3a、6和宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)的志贺氏菌O
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多糖抗原。
[0004]这四种生物缀合物可以通过从细胞底物开始的过程单独生产。所有四种细胞底物的共同点是相同类型的原始宿主，使用O
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多糖簇替代多糖生物合成(rfb)簇，引入编码载体蛋白的质粒和编码寡糖基转移酶PgIB或PgIL的质粒。

技术介绍

[0005]腹泻病(DD)是中低收入国家(LMIC)儿童/婴儿的一种重要疾病。根据《2015年全球疾病负担》，腹泻是儿童死亡的第四大原因，占五岁以下儿童死亡总数的8.6％。尽管LMIC中的儿童需要针对志贺氏菌的疫苗，但目前市场上没有疫苗。
[0006]志贺氏菌是导致LMIC中1岁以上儿童DD的主要病原体，也是导致1岁以下儿童腹泻的六大病原体之一(1
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3)。约11％的腹泻死亡是由志贺氏菌引起的，导致每年55,900至65,000人死亡，其中大部分是儿童。志贺氏菌是一种革兰氏阴性非产孢、兼性厌氧菌和灵长类限制性病原体。传播可通过粪口途径，通过受污染的水、霉菌、食物或直接接触发生。低细菌负荷(100至1000之间的菌落形成单位)可导致有症状的感染。
[0007]在1至4天之间的潜伏期后，志贺氏菌病通常被诊断为发烧、水样腹泻、肠道症状，如厌食、腹部痉挛和呕吐，以及痢疾(急性结肠/直肠远端结肠炎，粪便中有血)。这些临床表现通常在免疫能力强的成年人中自我限制，而在5岁以下的儿童中，其可能导致肠道或代谢并发症，中毒性巨结肠和溶血性尿毒症综合征是主要并发症(即肠穿孔、直肠脱垂或低血糖、低钠血症、脱水)。
[0008]与志贺氏菌感染急性期相关的临床结局，特别是如果反复和长期感染，也会导致感染后并发症，如反应性关节炎和肠易激综合征，以及认知能力降低和年龄身高Z(HAZ)评分下降的发育并发症。事实上，DD的无形影响对儿童和家庭产生了长期影响，沉重的负担导致家庭层面的进一步贫困，失去上学机会导致潜在收入减少。
[0009]目前的疾病负担估计可能仍然不能充分反映DD的发病率，这受到不同研究中使用的各种方法以及所使用的诊断技术的敏感性的影响。志贺氏菌通常通过粪便培养分离，随后的标准生化检测和通过血清凝集进行血清分型来诊断。从粪便中分离病原体菌落是耗时且困难的，特别是如果使用抗生素或细菌在培养时仍处于非分裂状态时。传统培养诊断方法报告的这些挑战突出了对非培养依赖性新方法(如定量PCR)的需求。事实上，对来自(全
球肠道多中心研究)和MAL
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ED(肠道感染和营养不良的病因、风险因素和相互作用以及对儿童健康和发展的后果)研究的样本子集进行重新分析的结果表明，此前对儿童志贺氏菌引起的腹泻的研究可能低估了真实发病率至少两倍。
[0010]该疾病的一般临床治疗包括补液(口服或静脉内)、补锌和抗生素治疗。然而，对传统一线和二线抗生素如氨苄青霉素/甲氧苄啶
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磺胺甲噁唑或环丙沙星/阿奇霉素的耐药性的报道越来越多。因此，由于最初的治疗可能失败，耐药感染可能比易感细菌感染持续更长时间，从而导致更严重的临床结局和更高的医疗系统成本。
[0011]通过引入有效和负担得起的疫苗来预防志贺氏菌引起的DD，在LMIC中尤为重要，在LMIC中，其他干预措施，即医疗保健服务、安全用水、卫生和个人卫生很难在短期内实现。
[0012]对志贺氏菌的免疫似乎具有菌株特异性。志贺氏菌属有四个种：福氏菌种、宋内氏菌种、鲍氏菌种和痢疾菌种，其分别具有19、20、1和15个血清型(O抗原结构不同)。重要的疫苗研发考虑因素是志贺氏菌血清型的分布。发展中国家儿童中导致中度至重度疾病的主要血清型是福氏志贺氏菌2a型、S.sonnei和S.flexneri 3a型和6型。[1][2]特别是，全球志贺氏菌种分布的长期趋势表明，与S.flexneri水平居高不下且地理分布极不均匀的农村地区相比，在经历了显著工业化的地区，S.sonnei的数量有所增加。
[0013]提供针对志贺氏菌的疫苗的需求仍未得到满足。合成具有特定还原性末端糖的生物偶联物也存在困难。

技术实现思路

[0014]利用生物缀合技术开发了多价志贺氏菌缀合物。疫苗候选物志贺氏菌四价(Shigella4V(S
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4V))是一种免疫原组合物，其由四种不同志贺氏菌菌株的O
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抗原多糖(PS)生物缀合物组成，这四种不同的志贺氏菌菌株代表了最具流行病学相关性的菌株：S.sonnei(SsE)，S.flexneri 2a、3a和6(Sf2E、Sf3E、Sf6E)。在一个实施方式中，每种PS缀合物至重组铜绿假单胞菌外蛋白A，rEPA。候选物包含与蛋白载体共价连接的福氏志贺氏菌血清型2a、3a、6和宋内志贺氏菌的志贺氏菌O
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多糖抗原。
[0015]例如，对于Sf2E、Sf3E和Sf6E，多糖通过O
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抗原的还原末端共价连接至天冬酰胺残基(4)的侧链氮原子上，天冬酰胺的残基位于N
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糖基化的共有序列中(见表3)。信号肽(带下划线的字母)在易位至胞质过程中被切割。N
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糖基化共有位点用粗体字母标记。Leu
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Glu至Val的突变(斜体)导致EPA显著解毒。
[0016]对于SsE，多糖通过O
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抗原的还原末端共价连接至位于O
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糖基化位点的丝氨酸残基的侧链氧原子(见表4)。信号肽(带下划线的字母)在易位至胞质过程中被切割。O
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糖基化共有位点用粗体表示，假定O
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糖基化丝氨酸用下划线表示。Leu
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Glu至Val的突变(斜体)导致EPA显著解毒。
[0017]生物缀合技术是一种多用途的工具，可以以高收率提供安全、明确和免疫原性的糖缀合物疫苗。对于基于O
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抗原的疫苗，由于使用了常见的生物合成途径，该技术特别适合。生物缀合能够在工程化E.coli中合成具有复杂多糖结构的缀合物疫苗。生物缀合物是多糖和蛋白的免疫原性复合物，使用适当工程化的细菌细胞在体内直接合成。
[0018]空肠弯曲杆菌中N
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连接糖蛋白的鉴定表明，原核生物可以将其蛋白N
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糖基化。当位于蛋白载体的多肽链内的特定共有序列中时，特定弯曲杆菌酶(寡本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种免疫原组合物，其包含来自福氏志贺氏菌2a(Sf2E)、福氏志贺氏菌3a(Sf3E)、福氏志贺氏菌6(Sf6E)和宋内志贺氏菌(SsE)的每一种的O
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抗原多糖链；其中来自福氏志贺氏菌2a(Sf2E)、福氏志贺氏菌3a(Sf3E)、福氏志贺氏菌6(Sf6E)的所述O
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抗原多糖分别共价连接至蛋白载体，所述蛋白载体已被修饰以包含N
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糖基化共有序列。2.根据权利要求1所述的免疫原组合物，其中所述N
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糖基化共有序列是D/E
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X
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N
‑
Z
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S/T(SEQ ID NO:31)，其中X和Z可以是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，并且任选地其中PgIB用于将所述多糖转移到所述N
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糖基化共有序列D/E
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X
‑
N
‑
Z
‑
S/T(SEQ ID NO:31)，其中X和Z可以是除了脯氨酸以外的任何氨基酸。3.根据权利要求1或权利要求2所述的免疫原组合物，其中SsE共价连接至蛋白载体，所述蛋白载体包含能够被PgIL糖基化的O
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糖基化共有序列，任选地其中PgIL用于将所述多糖转移到针对SsE的所述共有序列TWPKDNTSAGVASSPTDIK(SEQ ID NO:29)。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的免疫原组合物，其中所述蛋白载体选自以下：霍乱毒素b亚单位(CTB)、破伤风类毒素(TT)、破伤风毒素C片段(TTc)、白喉类毒素(DT)、CRM197、铜绿假单胞菌外毒素A(EPA)、空肠弯曲杆菌吖啶黄抗性蛋白A(CjAcrA)、E.coli吖啶黄抗性蛋白A(EcAcrA)和铜绿假单胞菌PcrV(PcrV)。5.根据权利要求4所述的免疫原组合物，其中所述蛋白载体是铜绿假单胞菌A(EPA)。6.根据权利要求5所述的免疫原组合物，其中所述蛋白载体包含至少两个N
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糖基化共有序列。7.根据权利要求6所述的免疫原组合物，其中所述蛋白载体在一个(单糖基化)、两个(双糖基化)或所有三个N
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糖基化位点(三糖基化)处糖基化。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的免疫原组合物，其中Sf2E、Sf3E和Sf6E的所述多糖通过所述O
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抗原的还原末端共价连接至天冬酰胺残基的侧链氮原子。9.根据权利要求8所述的免疫原组合物，其中所述天冬酰胺残基在所述D/E
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X
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N
‑
Z
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S/T(SEQ ID NO:31)N
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糖基化共有序列。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的免疫原组合物，其中SsE的所述多糖通过所述O
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抗原的所述还原末端共价连接；其中聚糖具有以下还原末端结构(i)葡萄糖、半乳糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc、diNAcBac或Pse的还原末端结构；(ii)DATDH、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、半乳糖或葡萄糖的还原末端结构；(iii)GlcNAc、GalNAc、FucNAc或葡萄糖的还原末端结构；或者(iv)半乳糖
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β1,4
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葡萄糖；葡萄糖醛酸
‑
β1,4
‑
葡萄糖；N
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乙酰基
‑
葡糖胺
‑
α1,3
‑
N
‑
乙酰基
‑
半乳糖胺；半乳糖
‑
β1,4
‑
葡萄糖；鼠李糖
‑
β1,4
‑
葡萄糖；呋喃半乳糖
‑
β1,3
‑
葡萄糖；N
‑
乙酰基
‑
阿楚糖醛酸
‑
α1,3
‑4‑
氨基
‑
N
‑
乙酰基
‑
葡糖胺；或鼠李糖
‑
β1,4
‑
N
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乙酰基半乳糖胺的S
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2至S
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1还原末端结构。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的免疫原组合物，其中所述福氏志贺氏菌2a、福氏志贺氏菌3a、福氏志贺氏菌6抗原通过D
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GlcNAc还原末端连接至所述N
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糖基化共有位点中的一个的天冬酰胺残基的ε
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氮原子。12.一种革兰氏阴性宿主细胞，其不是宋内志贺氏菌，其包含来自宋内志贺氏菌(SsE)的所述O
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抗原多糖。
13.根据权利要求12的宿主细胞，其是奈瑟氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌、假单胞菌或耶尔森氏菌细胞。14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其是大肠杆菌(E.coli)。15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所述E.coli是基因修饰的。16.根据权利要求12
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15中任一项所述的宿主细胞，其包含编码所述载体蛋白EPA的质粒，任选地包含至少一个适于被PgIL糖基化的O
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糖基化共有序列，任选地包含所述氨基酸序列TWPKDNTSAGVASSPTDIK(SEQ ID NO:29)。17.根据权利要求12
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16中任一项所述的宿主细胞，其包含编码寡糖基转移酶PgIL的质粒。18.一种生产四价生物缀合物疫苗的方法，所述生物缀合物疫苗包含来自福氏志贺氏菌2a(Sf2E)、福氏志贺氏菌3a(Sf3E)、福氏志贺氏菌6(Sf6E)和宋内志贺氏菌(SsE)的所述O
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抗原多糖链；其包括以下步骤：a)在适于生物缀合物生产的条件下培养四...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：葛兰素史克生物有限公司，
类型：发明
国别省市：