一种沙门菌灭活疫苗的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种沙门菌基因突变株灭活疫苗的制备方法及应用，利用λ

【技术实现步骤摘要】
一种沙门菌灭活疫苗的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及兽医学生物制品
，具体为一种沙门菌灭活疫苗的制备方法以及一种沙门菌灭活疫苗的应用。

技术介绍

[0002]沙门菌是一类重要的食源性病原微生物，该病原血清型多达2500多种，其中大多数具有致病性，导致动物的腹泻、肠炎、败血症及母畜流产，对畜禽养殖的意义重大。患病和带菌动物是本病的主要传染源，不仅在种群中持续排毒，也可以垂直传播给下一代。传统的根据临床病症对群体进行阳性净化的方法无法及时淘汰隐性感染群体，对沙门菌的净化工作需要采取疫苗免疫和血清学检测相配合的方案，因此亟需开发一种DIVA(Differentiation of Infected and Vaccinated Animals)疫苗，可以在血清学检测中区分临床感染和人工免疫。
[0003]PagC蛋白是沙门菌属内高度保守的特异性蛋白，属内的同源性高达95％以上。编码该蛋白的pagC基因广泛分布于各类禽源和鼠源的沙门菌血清型中，是标记疫苗理想的鉴别诊断靶点。
[0004]基于上述考虑，本专利技术人在前期实验室利用λ
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Red同源重组法获得的鸡白痢沙门菌ΔPagC突变株基础上，研制了一种沙门菌灭活疫苗，并对其免疫效果和DIVA特性进行了评估。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种沙门菌基因突变株灭活疫苗的制备方法及应用，疫苗株接种小鼠后无不良反应，可保护小鼠应对鸡白痢沙门菌CVCC1800、肠炎沙门菌ATCC19585和鼠伤寒沙门菌CVCC542的感染，该疫苗能够能与基于PagC蛋白的沙门菌抗体间接ELISA检测试剂盒联用，实现沙门菌人工免疫和自然感染的鉴别诊断，表现出良好的DIVA特性。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基因突变株沙门菌灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0007]步骤S1，利用λ
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Red系统制备获得鸡白痢沙门菌基因缺失突变株ΔPagC；
[0008]步骤S2，缺失株LB平板划线，挑取单菌落转接到新鲜的LB培养基中过夜培养；
[0009]步骤S3，取过夜培养的鸡白痢沙门菌ΔPagC菌液，1:100接种到50ml液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养至OD值约0.8；
[0010]步骤S4，加入终浓度为0.4％的甲醛溶液，继续振荡培养16h，4℃、5000rpm离心10min后收集菌体，用无菌的PBS缓冲液洗涤重悬3次后获得原液；
[0011]步骤S5，多次调整原液使其稀释10倍后测OD值为1(此时原液的浓度大约在109CFU/ml)；
[0012]步骤S6，将原液浓缩一倍后与佐剂进行1:1混合，然后加到2ml的灭菌匀浆管(含钢珠)中，使用组织匀浆仪中进行乳化，待乳化完全后，取100μl均匀涂布于LB固体培养基上，
37℃培养16h后观察无菌落长出，此时成功制备鸡白痢沙门菌CVCC1800ΔPagC甲醛灭活苗。
[0013]一种沙门菌灭活疫苗的应用，包括鸡白痢沙门菌CVCC1800ΔPagC甲醛灭活苗的免疫保护试验和鸡白痢沙门菌CVCC1800ΔPagC甲醛灭活苗的DIVA特性评估。
[0014]进一步的，步骤S1中的野生型鸡白痢沙门菌CVCC1800来源为中国兽医药品监察所。
[0015]进一步的，步骤S6中的佐剂类型为ISA206。
[0016]进一步的，鸡白痢沙门菌CVCC1800ΔPagC甲醛灭活苗的免疫保护试验；
[0017]5.1免疫原性试验：血清效价检测
[0018]将制备的CVCC1800ΔPagC疫苗株对3
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4周龄ICR小鼠进行皮下多点注射，注射剂量为1x10
8 CFU/只，每组4只，同时设立注射PBS的阴性对照组，注射剂量为每只100μl；免疫分为3次进行，每次免疫间隔为14天；首免前和每次免疫后第13天下颌静脉采血，次日分离血清进行间接ELISA试验，将每份血清样品1:400稀释后检测其血清效价；
[0019]随着免疫次数的增加，疫苗组小鼠的抗体效价逐步上升，在三免后达到高峰，与PBS对照组差异极其显著；
[0020]5.2保护效力试验
[0021]三免后第14天对小鼠进行腹腔攻毒，攻毒后每天观察存活状态，绘制存活曲线并计算免疫保护率；
[0022]5.3盲肠病理组织变化
[0023]疫苗三免后第14天，用上述三株不同血清型的沙门菌攻毒；根据小鼠的临床症状陆续将其处死，观察盲肠组织的病理变化；
[0024]盲肠病理变化：三株不同血清型沙门菌感染小鼠后，其免疫组的盲肠粘膜层细胞出现轻微坏死脱落；对应的PBS阴性对照组小鼠的盲肠粘膜层受损严重，结构无法清晰辨别。
[0025]进一步的，野生型肠炎沙门菌CVCC1800和鼠伤寒沙门菌CVCC542来源为中国兽医微生物菌种保藏管理中心。
[0026]进一步的，鸡白痢沙门菌CVCC1800ΔPagC甲醛灭活苗的DIVA特性评估；
[0027]以PagC抗原包被ELISA酶标板，评价沙门菌ΔPagC疫苗的鉴别诊断效果。抗原包被浓度为2μg/ml，血清稀释倍数为1：400。阳性血清由鸡白痢沙门菌CVCC1800野生株多次腹腔感染小鼠后分离获得。
[0028]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0029]本专利技术通过制备沙门菌灭活疫苗，疫苗株接种小鼠后无不良反应，可保护小鼠应对鸡白痢沙门菌CVCC1800、肠炎沙门菌ATCC19585和鼠伤寒沙门菌CVCC542的感染，该疫苗能够能够与基于PagC蛋白的沙门菌抗体间接ELISA检测试剂盒联用，实现沙门菌人工免疫和自然感染鉴别诊断，表现出良好的DIVA特性。
附图说明
[0030]图1为本专利技术的三株不同血清型沙门菌的攻毒剂量及免疫保护率示意图；
[0031]图2为本专利技术的抗体效价检测结果示意图；
[0032]图3为本专利技术的示意图疫苗免疫后小鼠感染鸡白痢沙门菌CVCC1800存活曲线；
[0033]图4为本专利技术的疫苗免疫后小鼠感染肠炎沙门菌ATCC19585存活曲线示意图；
[0034]图5为本专利技术的疫苗免疫后小鼠感染鼠伤寒沙门菌CVCC542存活曲线示意图；
[0035]图6为本专利技术的盲肠组织病理变化示意图。
[0036]图7为本专利技术的基于PagC抗原评价疫苗的鉴别诊断效果示意图；
具体实施方式
[0037]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0038]请参阅图1
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7，本专利技术提供一种技术方案：一种沙门菌灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种沙门菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1，利用λ
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Red系统制备获得鸡白痢沙门菌基因缺失突变株ΔPagC；步骤S2，缺失株LB平板划线，挑取单菌落转接到新鲜的LB培养基中过夜培养；步骤S3，取过夜培养的鸡白痢沙门菌ΔPagC菌液，1:100接种到50ml液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养至OD值约0.8；步骤S4，加入终浓度为0.4％的甲醛溶液，继续振荡培养16h，4℃、5000rpm离心10min后收集菌体，用无菌的PBS缓冲液洗涤重悬3次后获得原液；步骤S5，多次调整原液使其稀释10倍后测OD值为1(此时原液的浓度大约在109CFU/ml)；步骤S6，将原液浓缩一倍后与佐剂进行1:1混合，然后加到2ml的灭菌匀浆管(含钢珠)中，使用组织匀浆仪中进行乳化，待乳化完全后，取100μl均匀涂布于LB固体培养基上，37℃培养16h后观察无菌落长出，此时成功制备鸡白痢沙门菌CVCC1800ΔPagC甲醛灭活苗。2.根据权利要求1所述的一种沙门菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S1中的野生型鸡白痢沙门菌CVCC1800来源为中国兽医药品监察所。3.根据权利要求1所述的一种沙门菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S6中的佐剂类型为ISA206。4.一种沙门菌灭活疫苗的应用，其特征在于：包括鸡白痢沙门菌CVCC1800ΔPagC甲醛灭活苗的免疫保护试验和鸡白痢沙门菌CVCC1800ΔPagC甲醛灭活苗的DIVA特性评估。5.根据权利要求4所述的一种沙门菌灭活疫苗的应用，其特征在于：鸡白痢沙门菌CVCC1800ΔPagC甲醛灭活苗的免疫保护试验...

【专利技术属性】
技术研发人员：马喆，左庚亮，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：