用于测试安得塞奈效力的方法技术

本披露涉及用于测量安得塞奈样品在中和因子Xa抑制剂并恢复野生型因子Xa活性中的效力的试剂盒和方法。力的试剂盒和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测试安得塞奈效力的方法
[0001]相关申请的交叉引用本申请要求2020年6月16日提交的美国申请号63/039,795的优先权权益，将该文献通过引用并入本文以用于所有目的。

技术介绍

[0002]安得塞奈α（凝血因子Xa[重组]灭活的zhzo）是一种修饰的重组灭活形式的因子Xa，经特别设计用于结合并隔离因子Xa抑制剂。因子Xa抑制剂（例如阿哌沙班、利伐沙班、依度沙班、贝曲西班和依诺肝素）是常用的抗凝剂。然而，这样的抗凝剂的使用与急性大出血发作相关。安得塞奈α或安得塞奈是预防和阻止这样的出血的有效解毒剂。
[0003]重要的是在使用前对每一批次的安得塞奈的活性和效力进行评价。

技术实现思路

[0004]本披露提供了用于测量测试样品中安得塞奈α的效力（活性）的组合物、试剂盒和方法。可以基于测试样品在与fXa抑制剂一起的混合物中恢复人野生型fXa活性的能力来定量效力。人fXa的活性可以用例如来自已经建立了国际参考标准品的牛或人的fXa蛋白进一步校准。
[0005]本披露的一个实施例提供了一种用于确定安得塞奈样品的活性的方法，该方法包括将包含安得塞奈的测试样品与包含人因子Xa（HFXa）和直接因子Xa（fXa）抑制剂的混合物混合，其中该FXa与该Xa抑制剂的摩尔比是0.2 : 1至0.3 : 1；向该混合物中添加显色fXa底物，其中该显色fXa底物能够在与该HFXa反应时释放生色团；检测释放的生色团的量；以及从释放的生色团的量计算安得塞奈样品在从直接fXa抑制剂释放HFXa中的活性。
[0006]另一实施例提供了一种用于确定安得塞奈样品的活性的方法，该方法包括：将包含安得塞奈的测试样品与包含牛因子Xa（BFXa）和直接因子Xa（fXa）抑制剂的混合物混合，其中该BFXa与该fXa抑制剂的摩尔比是0.15 : 1至0.25 : 1；向该混合物中添加显色fXa底物，其中该显色fXa底物能够在与该BFXa反应时释放生色团；检测释放的生色团的量；以及从释放的生色团的量计算安得塞奈样品在从直接fXa抑制剂释放BFXa中的活性。
附图说明
[0007]作为本披露的实施例，提供了仅通过示例而非限制说明的附图，其中：图1比较了人fXa相比于牛fXa（Hyphen BFXa）切割Spectrozyme
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fXa底物的酶活性。按250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625、0 ng/mL将人fXa（）或BFXa（）连续稀释于1xTBS（pH7.4，0.1% BSA）中。将连续稀释的fXa（100 μL）与50 μL Spectrozyme
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fXa（2 mM）混合。在室温下孵育10 min后，通过添加50 μL乙酸淬灭反应。基于斜率（OD405 nm相比于浓度），牛fXa的活性比HFXa低大约31%。
[0008]图2A
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2C通过在直接效力测定中匹配酶浓度来比较牛fXa和人fXa。2A. BFXa（1x）/贝曲西班（1x）；2B. BFXa（1x）/贝曲西班（1.5x）；2C. BFXa（1x）/贝曲西班（2x）。首先分别制
备HFXa、BFXa和贝曲西班的储备溶液。通过以下制备FXa/贝曲西班混合物：混合不同体积的FXa和贝曲西班的储备溶液，得到HFXa/贝曲西班或BFXa/贝曲西班。如直接效力测定中所述，将FXa/贝曲西班混合物（50 μL）添加到反应混合物中。使用HFXa（1x）/贝曲西班（1x）混合物（）作为对照。在保持相同浓度的BFXa（1x）的同时，在不同浓度的贝曲西班下测试BFXa/贝曲西班混合物（）。小图a)：BFXa（1x）/贝曲西班（1x）；小图b：BFXa（1x）/贝曲西班（1.5x）；小图c)：BFXa（1x）/贝曲西班（2x）。
[0009]图3A
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3B示出了通过匹配酶活性得到的牛FXa和贝曲西班浓度的优化结果。3A. BFXa（1.64x）/贝曲西班（2x）；3B. BFXa（1.45x）/贝曲西班（2x）。首先分别制备HFXa、BFXa和贝曲西班的储备溶液。通过以下制备FXa/贝曲西班混合物：混合不同体积的FXa和贝曲西班的储备溶液，得到HFXa/贝曲西班或BFXa/贝曲西班。如直接效力测定中所述，将FXa/贝曲西班混合物（50 μL）添加到反应混合物中。使用HFXa（1x）/贝曲西班（1x）混合物（）作为对照。在保持相同浓度的贝曲西班（2x）的同时，在不同浓度的BFXa下测试BFXa/贝曲西班混合物（）。小图a)：BFXa（1.64x）/贝曲西班（2x）；小图b：BFXa（1.45x）/贝曲西班（2x）。
具体实施方式
[0010]I.定义所有数字表达，例如pH、温度、时间、浓度和分子量（包括范围）都是近似值，其以0.1的增量变化（+）或（
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）。应当理解的是，尽管不总是明确陈述，在所有数字表达前面加上术语“约”。还应当理解的是，尽管不总是明确陈述，本文所述的试剂仅是示例性的并且这样的试剂的等同物在本领域中是已知的。
[0011]“组合物”旨在意指活性剂和另一惰性化合物或组合物（例如，可检测的药剂或标签）或活性化合物或组合物的组合。
[0012]“因子Xa”或“fXa”或“fXa蛋白”是凝血途径中的丝氨酸蛋白酶，其由灭活的因子X（fX）产生。编码人因子X（“fX”）的核苷酸序列可以在GenBank登录号“NM_000504”中找到。在重链的前52个残基的催化裂解后，fX被活化为fXa（SEQ ID NO: 1，表1）。FXa含有轻链和重链（如表1中所示）。该轻链的前45个氨基酸残基（SEQ ID NO: 1的残基1
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45）称为Gla结构域，因为它含有11个翻译后修饰的γ
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羧基谷氨酸残基（Gla）。它还含有短的（6个氨基酸残基）芳香堆叠序列（SEQ ID NO: 1的残基40
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45）。胰凝乳蛋白酶消化选择性地去除1
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44残基，导致无Gla结构域fXa。fXa的丝氨酸蛋白酶催化结构域位于C
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末端重链上。fXa的重链与其他丝氨酸蛋白酶（如凝血酶、胰蛋白酶、和激活的蛋白C）高度同源。
[0013]“天然fXa”或“野生型fXa”是指天然存在于血浆中或以其原始的未修饰形式分离的fXa，其具有激活凝血酶原的生物活性，因此促进血液凝块的形成。该术语包括从组织样品中分离的天然存在的多肽以及重组产生的fXa。“活性fXa”是指具有激活凝血酶原的生物学活性的fXa。“活性fXa”可以是保留促凝血活性的天然fXa或经修饰的fXa。
[0014]如本文所用，“fXa衍生物”是指修饰的fXa蛋白，其具有Gla结构域的修饰或大量缺失（例如，至少50%、60%、70%、80%或90%的轻链氨基酸残基6
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39的缺失）和活性位点的修饰，使得与野生型蛋白相比，fXa衍生物在组装到凝血酶原酶复合物方面的能力降低，并且催化活本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于确定安得塞奈样品的活性的方法，该方法包括：将包含安得塞奈的测试样品与包含人因子Xa（HFXa）和直接因子Xa（fXa）抑制剂的混合物混合，其中该fXa与该fXa抑制剂的摩尔比是0.2 : 1至0.3 : 1；向该混合物中添加显色fXa底物，其中该显色fXa底物能够在与该HFXa反应时释放生色团；检测释放的生色团的量；以及从该释放的生色团的量计算该安得塞奈样品在从该直接fXa抑制剂释放该HFXa中的活性。2.如权利要求1所述的方法，其中该HFXa与该fXa抑制剂的摩尔比是0.22至0.28。3.如权利要求1所述的方法，其中该HFXa与该fXa抑制剂的摩尔比是0.24至0.26。4.如任一前述权利要求所述的方法，其中在添加该测试样品后，该HFXa具有约8至14 nM的浓度。5.如权利要求4所述的方法，其中在添加该测试样品后，该HFXa具有约10至12 nM的浓度。6.如任一前述权利要求所述的方法，其中该直接fXa抑制剂选自由以下组成的组：贝曲西班、阿哌沙班、利伐沙班、依度沙班、奥米沙班、利他沙班和艾立沙班。7.如权利要求6所述的方法，其中该直接fXa抑制剂是贝曲西班。8.如任一前述权利要求所述的方法，其中该显色fXa底物是spectrozyme
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Xa。9.如任一前述权利要求所述的方法，该方法进一步包括用参考安得塞奈样品生成的标准曲线验证该安得塞奈样品的活性。10.一种用于确定安得塞奈...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔尔，
申请(专利权)人：阿雷克森制药公司，
类型：发明
国别省市：