一种解淀粉芽孢杆菌YN48菌株及其快速扩繁体系制造技术

本发明专利技术涉及一种解淀粉芽孢杆菌YN48菌株及其快速扩繁体系，为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）YN48菌株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：CGMCC No：25275；保藏时间2022年7月11日；其应用为防治烟草黑胫病。本发明专利技术结构简单，操作简便，抗污染，通过对培养基进行加热消毒并冷却后即可接种，添加真菌抑菌剂抑制真菌污染，使操作过程不用高压灭菌而更加简单，持续的通氧发酵能显著提高发酵效率，能实现非专业人员在普通的环境条件下发酵生产出所需的新鲜菌液，提升生防菌的使用效果，降低使用成本，降低生防菌技术推广使用壁垒。降低生防菌技术推广使用壁垒。降低生防菌技术推广使用壁垒。

【技术实现步骤摘要】
一种解淀粉芽孢杆菌YN48菌株及其快速扩繁体系


[0001]本专利技术属于菌种发酵
，尤其是涉及一种解淀粉芽孢杆菌YN48菌株及其快速扩繁系统及其方法


技术介绍

[0002]烟草黑胫病是由烟草疫霉菌引起的严重烟草病害，且广泛的存在于我国的烟草种植行业中。同时，随着近年来烟叶种植布局的优化调整加之大气温室效应的影响，这种病害在全国范围内的影响也是呈逐年递增的趋势。
[0003]我国传统的防治方法采用的是施用甲霜
·
锰锌，但长期的使用使其产生了相应的抗药性。为寻找新的解决方案，有研究发现烟草内生拮抗细菌具有抑制病原菌的功能。通过大量对烟草黑胫病拮抗菌的筛选和鉴定，我们筛选出与施用甲霜
·
锰锌具有相似功能的防治烟草黑胫病生防菌解淀粉芽孢杆菌YN48菌株，并进一步研究解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的大田应用效果。
[0004]在大田实验中，菌株的高效制备是生产应用的核心问题，但由于传统的菌种发酵的专业性强，发酵设备要求高、发酵成本过大、活性不高等诸多因素，使得菌株生产应用受到影响，目前芽孢杆菌相关产品的菌体均以芽孢形式存在，使其货架期能显著提高，但也造成在其应用时芽孢需要在一定条件下萌发后才能形成活性的菌体，进而发挥其生防菌功能，这在一定程度上会影响其应用效果，可见构建结构简单、操作便捷、能高效生产高活性芽孢杆菌菌体的快速扩繁体系是非常必要的。

技术实现思路

[0005]本专利技术正是为了解决上述问题缺陷，提供一种解淀粉芽孢杆菌YN48菌株及其快速扩繁系统及其方法。
[0006]本专利技术采用如下技术方案实现。
[0007]一种细菌，所述的细菌菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）YN48菌株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：CGMCC No：25275；保藏时间2022年7月11日。
[0008]本专利技术所述细菌的应用为防治烟草黑胫病。
[0009]本专利技术所述细菌的培养基，其特征在于，所述的培养基配方包括蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉10g/L，磷酸氢二铵1g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、硫酸锰0.25g/L；使用NaOH溶液调节培养基至pH为7.0。
[0010]本专利技术所述NaOH溶液的浓度为1
‑
4mol/L。
[0011]本专利技术所述细菌的培养条件为温度为30℃
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40℃，维持pH为5.5
‑
7.5，全程通氧发酵。
[0012]进一步为，本专利技术所述的培养条件为温度为34℃。
[0013]一种发酵解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的快速扩繁系统，本专利技术所述的快速扩繁系统
包括制氧机1、小型空气压缩机2、空气过滤器3、多头可调节式分气阀4、水质测定仪5、温度探头6、溶氧探头7、pH探头8、蠕动泵9、棉花塞10、加热棒11、曝气头12、发酵桶13；所述的制氧机1、小型空气压缩机2、空气过滤器3、多头可调节式分气阀4依序连接；多头可调节式分气阀4与曝气头12连接；温度探头6、溶氧探头7、pH探头8分别与水质测定仪5连接；水质测定仪5和蠕动泵9设置在发酵桶13一侧；蠕动泵9的泵头、温度探头6、溶氧探头7、pH探头8、加热棒11、曝气头12设置在发酵桶13内部；棉花塞10设置在发酵桶13的桶口处。
[0014]一种利用快速扩繁系统发酵解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的方法，本专利技术所述方法包括如下步骤：步骤1：在超净工作台内打开解淀粉芽孢杆菌YN48菌株平板，用移液枪往平板上加入5mL无菌水后并多次吸打，使解淀粉芽孢杆菌YN48菌株芽孢悬浮在无菌水中，之后用移液枪吸取悬液打入事先准备好的装有1L LB液体培养基的锥形瓶中，封好瓶口；步骤2：将锥形瓶放入设置温度为37℃，150r/min的摇床中培养12h；步骤3：取洁净18.9L桶装水桶作为发酵桶，以发酵体积为15L配制解淀粉芽孢杆菌YN48菌株培养基，蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉10g/L，磷酸氢二铵1g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、硫酸锰0.25g/L，将配好的培养基放入锅中，加水后总体积为1
‑
2L，在电磁炉上加热至沸腾，再持续沸腾5min后倒入发酵桶中；步骤4：发酵桶内加水定容至13L，用内置加热棒对发酵桶内用水以70℃加热30min，在此期间加入上述煮沸后的培养基，待桶内液体温度降至37℃以下，采取火焰接种法接入步骤1，2中摇好的生物量约为107CFU/mL的解淀粉芽孢杆菌YN48菌液，调节桶内pH在7.0左右；步骤5：将霉菌素、伊曲康唑、消泡剂加入到发酵桶内，放入灭菌后的恒温加热棒、补料管、曝气头、温度探头、pH探头、溶氧探头；用灭菌后的棉花塞封住罐口；步骤6：打开制氧机开关，控制进氧量在5L/min以上；打开恒温加热棒开关，设置恒温温度在34℃；打开小型空气压缩机开关，增大通氧压力，利用通入的氧气使发酵桶内液体翻腾，从而实现搅拌效果；步骤7：在此期间监测发酵时的溶氧、pH、温度变化情况，在pH低于5.5时用蠕动泵进行补碱，在溶氧值百分比低于1%时逐渐增大氧气供应量；发酵期间温度不应高于37℃；步骤8：发酵期间利用蠕动泵吸取发酵桶内菌液，在显微镜下制片观察解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的生长状况并利用精子计数板在显微镜下进行计数；在发酵指数生长期过后，观察到溶氧值回升用蠕动泵补入20g/L葡萄糖；步骤9：当发酵时间超过12h后，溶氧值开始回升，用蠕动泵吸取桶内发酵液，利用精子计数板在显微镜下计数，计数值在5.0
×
109CFU/mL以上时，可进行下罐得到所需解淀粉芽孢杆菌YN48菌液。
[0015]本专利技术上述步骤5中的灭菌具体为：除恒温加热棒、温度探头、pH探头、溶氧探头采用清水及酒精清洗消毒；其余在高压蒸汽灭菌锅下115℃，20min，或在沸水中煮沸10
‑
15min的方式进行灭菌操作。
[0016]本专利技术的有益效果为，（1）采用快速扩繁体系进行解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的发酵，设备较少，操作简单，降低了操作的复杂性。
[0017]（2）无大功率或大功耗用电器，常温常压下发酵，操作过程无绝对硬性规程，操作的缓适性强，可以在乡村田间等不同环境进行技术调整，适用于绝大部分大田发酵的场所。
[0018]（3）基于本菌株生长速度快，本专利技术集成流加补料等高密度发酵技术、高生物量接种和添加真菌生长抑制剂，使发酵过程很大程度杜绝污染，发酵产物生物量大，发酵所需时间短。
[0019]（4）在大田旁直接进行发酵，下罐菌液可直接应用到所需处，无货架期，菌种活性高，极大程度提高了菌液的作用效果。
[0020]总之本专利技术方法设备简洁，操作简便，发酵菌体生物量大，无污染，能够实现短时间内的高密度发酵，使菌体在最佳活性时应用在大田实验中。
[0021]下面结合附图及其具体实施方式本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细菌，其特征在于，所述的细菌菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）YN48菌株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：CGMCC No：25275；保藏时间2022年7月11日。2.根据权利要求1所述细菌的应用，其特征在于，所述的应用为防治烟草黑胫病。3.根据权利要求1所述细菌的培养基，其特征在于，所述的培养基配方包括蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉10g/L，磷酸氢二铵1g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、硫酸锰0.25g/L；使用NaOH溶液调节培养基至pH为7.0。4.根据权利要求3所述细菌的培养基，其特征在于，所述NaOH溶液的浓度为1
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4mol/L。5.根据权利要求1所述细菌的培养条件，其特征在于，所述的培养条件为温度为30℃
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40℃，维持pH为5.5
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7.5，全程通氧发酵。6.根据权利要求1所述细菌的培养条件，其特征在于，所述的培养条件为温度为34℃。7.一种发酵解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的快速扩繁系统，其特征在于，所述的快速扩繁系统包括制氧机（1）、小型空气压缩机（2）、空气过滤器（3）、多头可调节式分气阀（4）、水质测定仪（5）、温度探头（6）、溶氧探头（7）、pH探头（8）、蠕动泵（9）、棉花塞（10）、加热棒（11）、曝气头（12）、发酵桶（13）；所述的制氧机（1）、小型空气压缩机（2）、空气过滤器（3）、多头可调节式分气阀（4）依序连接；多头可调节式分气阀（4）与曝气头（12）连接；温度探头（6）、溶氧探头（7）、pH探头（8）分别与水质测定仪（5）连接；水质测定仪（5）和蠕动泵（9）设置在发酵桶（13）一侧；蠕动泵（9）的泵头、温度探头（6）、溶氧探头（7）、pH探头（8）、加热棒（11）、曝气头（12）设置在发酵桶（13）内部；棉花塞（10）设置在发酵桶（13）的桶口处。8.一种利用快速扩繁系统发酵解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1：在超净工作台内打开解淀粉芽孢杆菌YN48菌株平板，用移液枪往平板上加入5mL无菌水后并多次吸打，使解淀粉芽孢杆菌YN48菌株芽孢悬浮在无菌水中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘剑金，何鹏博，申宴斌，王学坚，张艳，莫明和，汪林涛，汪中，吴中红，罗巍，石雯，黄德华，
申请(专利权)人：云南省烟草公司普洱市公司，
类型：发明
国别省市：