分泌抗马铃薯帚顶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分泌抗马铃薯帚顶病毒(Potato mop

【技术实现步骤摘要】
分泌抗马铃薯帚顶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种分泌抗马铃薯帚顶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

技术介绍

[0002]马铃薯帚顶病毒(Potato mop
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top virus,PMTV)是植物杆状病毒科(Virgaviridae)、马铃薯帚顶病毒属(Pomovirus)的代表种，是拥有三分体基因组的正义单链RNA病毒(ssRNA)，RNA1长约6.0kb，RNA2长约3.5kb，RNA3长约2.5～3.0kb。病毒粒子形态为无包膜的刚直杆状，直径18～20nm，三种典型长度分别为65～80nm、150～160nm、290～310nm。PMTV的RNA1含有一个开放阅读框(ORF)，编码一个148kDa的蛋白和一个可能参与复制的206kDa的通读蛋白，其中148kDa蛋白N端有一个甲基转移酶(Mtr)结构域，C端有一个解旋酶(Hel)结构域。206kDa的通读蛋白C端有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)结构域。RNA2即RNA
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CP，编码一个以UAG终止的衣壳蛋白(CP)的ORF，并编码61
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79KDa的CP通读蛋白。RNA3编码一个三基因盒(Tripe gene block,TGB)和一个8K蛋白或称之为富含半胱氨酸蛋白(CRP)，TGB由三个部分重叠的ORF组成，即TGBp1、TGBp2和TGBp3。TGB在其他正链RNA病毒如Allexivirus、Benyvirus、Carlavvirus、Fovevirus、Hordeivirus、Pecluvirus和Potexvirus属中也存在。目前的研究证明PMTV的系统移动不依赖衣壳蛋白的表达和病毒粒子的组装，而这些TGB和8K蛋白通过互作参与了病毒的细胞间移动和系统运输。
[0003]PMTV侵染后症状取决于马铃薯品种和环境条件。温度较低时，症状可能会较明显，但随着温度升高，症状会减弱。叶片症状包括下部叶片出现亮黄色斑点、亮黄色“V”字形、弧形或环状图案，叶片变形，节间缩短；块茎上的症状通常包括坏死和内部变色，包括铁锈棕色的弧、环或斑点，有时，感染PMTV的块茎也可能不表现出症状；而块茎外部PMTV症状不常见，表现为表面环状隆起。
[0004]联合国粮农组织(FAO)数据显示，在2005年，发展中国家的马铃薯产量首次超过发达国家，而目前中国是最大的马铃薯生产国，中国的马铃薯种植面积和马铃薯产量占全球的20％以上。PMTV可导致马铃薯产量的重大损失。一项对苏格兰种薯的研究显示，PMTV引起的产量降幅高达67％。这种病毒还会引起块茎肉的扭曲和坏死造成形态缺陷，产生不美观的土豆，面临加工者和包装商的商业排斥。目前关于马铃薯帚顶病毒的研究在国外相对成熟，而在国内相关研究较少，但是近几年PMTV在国内多地均有报道，随着气候条件变化、种薯和组培苗引进等诸多因素的影响，PMTV的检验检疫亟需引起重视。
[0005]目前PMTV风险主要表现在：1)识别检测困难：侵染后症状受品种和气候影响，症状轻微时，易于其他病毒引起的黄叶症状混淆，块茎症状与TRV和PVY相似，不利于田间诊断、掌握疫情、针对性地除去病株；2)易于传播：PMTV主要经粉痂菌的游动孢子传播，而释放游动孢子的休眠孢子在干燥情况下保持2年以上仍可传播病毒，因此即使种薯本身不带毒，只要有带毒的休眠孢子附着在种薯上，就不能排除PMTV随种薯传入的可能性；3)一旦侵入难以根除：粉痂菌的休眠孢子以能抵御不良环境的孢子球形式存在，且其寄主又十分广泛，因
此，带毒的粉茄菌一旦传入就很难根除。目前PMTV传毒介体马铃薯粉痂菌在我国内蒙、吉林、甘肃、江西、福建、广东、贵州、云南等地均已发现，而且国内、国际种薯调运和种质资源交换频繁，致使该病毒扩散流行的风险很高。目前我国防止该病毒病的入侵主要策略是加强该病毒的检验检疫，种植无毒的马铃薯种薯种苗。
[0006]为强化我国PMTV的检验检疫技术，建立检测PMTV简单快捷、经济有效、高通量的实用检测技术是极其必要的。血清学方法较常规的指示植物接种、电镜观察、分子检测等方法具有简捷、经济、准确、高通量检测等优点，是植物病毒检测诊断最常用和最实用的方法之一。而血清学的方法的建立依赖于高质量的病毒抗体。本专利技术以原核表达的PMTV衣壳蛋白(CP)作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌PMTV特异性单抗的杂交瘤细胞株，以分泌的单抗为核心建立检测PMTV的高通量的dot
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ELISA血清学方法及试剂盒，为我国马铃薯中该病毒的检测诊断和口岸检验检疫、流行病学的调查、病毒基因组功能分析、抗性育种、科学防控建立等提供试剂和技术支持。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗马铃薯帚顶病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。
[0008]本专利技术具体采用的技术方案如下：
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种分泌抗马铃薯帚顶病毒单抗的杂交瘤细胞株4D2，它能分泌抗马铃薯帚顶病毒的特异性单抗，所述的杂交瘤细胞株4D2于2022年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45330。
[0010]第二方面，本专利技术提供了一种上述第一方面所述的杂交瘤细胞分泌的抗马铃薯帚顶病毒单克隆抗体。该单抗腹水间接ELISA效价达10
‑7，抗体类型及亚类为IgG1、κ轻链，与马铃薯帚顶病毒19.7kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立ACP
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ELISA和dot
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ELISA方法检测感染PMTV病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:10240和1:1280倍稀释(w/v,g/mL)。
[0011]所述的抗马铃薯帚顶病毒单克隆抗体能与马铃薯帚顶病毒(PMTV)有特异性免疫反应，而不与侵染马铃薯的马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯M病毒(PVM)，马铃薯A病毒(PVA)、烟草花叶病毒(TMV)反应，也不与健康马铃薯植物组织发生免疫反应。
[0012]第三方面，本专利技术提供了一种如上述第二方面所述抗马铃薯帚顶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用，它是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。
[0013]本专利技术与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株分泌大量抗PMTV特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的ACP
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ELISA、dot
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ELISA血清学等检测方法及其检测试剂盒能快速、特异、灵敏、准确地检测PMTV；2)利用本专利技术所制备的单克隆抗体检测PMTV病毒，对操作人员的技术要求低，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本专利技术所制备的单克隆抗体可有效地用于田间PMTV的检测诊断及口岸检验检疫，也可用于该病毒病的流行病学调查、病毒基因组功能分析、抗性育种、科学防控等方面。
附图说明...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分泌抗马铃薯帚顶病毒单抗杂交瘤细胞株4D2，其特征在于能分泌抗马铃薯帚顶病毒单抗，所述的杂交瘤细胞株4D2于2022年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45330。2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株4D2分泌的抗马铃薯帚顶病毒单抗。3.如权利要求2所述的抗马铃薯帚顶病毒单抗，其特征在于该单抗腹水间接ELISA效价达10
‑7，抗体类型及亚类为IgG1、κ轻链，该单抗与马铃薯帚顶病毒19.7kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立ACP
‑
ELISA和dot

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，郭萌萌，周雪平，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：