抗III型B群链球菌荚膜多糖单克隆抗体及杂交瘤细胞株制造技术

本发明专利技术公开了抗III型B群链球菌荚膜多糖单克隆抗体及杂交瘤细胞株。所述杂交瘤细胞株命名为WV

【技术实现步骤摘要】
抗III型B群链球菌荚膜多糖单克隆抗体及杂交瘤细胞株


[0001]本专利技术涉及单克隆抗体领域，尤其涉及抗III型B群链球菌荚膜多糖单克隆抗体及杂交瘤细胞株。

技术介绍

[0002]B群链球菌是一种常见的条件致病菌，是引起产褥期发热的常见病原体，无论孕妇以哪种方式分娩，这些细菌都可以引起产褥感染。B族链球菌引起的产褥感染大多呈单一细菌感染，症状出现早，高热(>38.8℃)、心动过速等。
[0003]B族链球菌也是引起孕妇菌血症和伤口感染的主要致病菌，还可发生链球菌性肺炎、脑膜炎、肝脓肿和败血症等，死亡率较高，有报道其死亡率可达29％～52％。
[0004]新生儿GBS感染也已引起全球卫生机构的广泛关注，目前普遍以患儿发病时间及临床表现的差异分类依据，将新生儿和婴儿GBS感染分为两型。(1)早发型感染：患儿出生后7d内发生且以生后24h内发生多见，主要临床表现为肺炎和败血症，其中GBS肺炎可有发绀、呼吸暂停及呼吸窘迫等严重症状。(2)晚发型感染：患儿出生7d后至出生后3个月发生，多见于足月儿，常呈隐匿性发病，主要临床表现为发热、嗜睡和颅内高压等。
[0005]随着妊娠期接种百白破疫苗安全性的证实，GBS疫苗的研制得到了推进。目前广泛应用的结合疫苗，将多糖与高免疫原性的蛋白载体共价偶联，免疫原性大大提高，近期较常用的蛋白载体是CRM197。Madhi学者等进行的这项大型随机双盲试验，与CRM197结合的GBS荚膜多糖三价疫苗，包含Ia、Ib和III血清型，可覆盖全球大约80％的GBS感染的新生儿侵袭性疾病。
[0006]但由于GBS的多种血清型具有部分相同的抗原表位，以及GBS荚膜多糖
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蛋白结合疫苗在制备过程中，存在空间屏蔽效应的可能，使得多糖的一些抗原表位被蛋白质所屏蔽；导致III型B群链球菌荚膜多糖不能被准确检测，目前，还未有人获得抗III型B群链球菌荚膜多糖的单克隆抗体。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种抗III型B群链球菌荚膜多糖单克隆抗体及杂交瘤细胞株，本专利技术提供的杂交瘤细胞株经传代稳定性实验证明：能稳定地、特异地分泌针对III型B群链球菌荚膜多糖的单克隆抗体。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案如下：一种分泌抗III型B群链球菌荚膜多糖单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞命名为WV
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GBSIII
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04，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO：C202028，保藏时间2020年12月11日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
[0009]第二方面，本专利技术还提供一种抗III型B群链球菌荚膜多糖的单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株分泌。
[0010]作为对上述方案的进一步描述：所述单克隆抗体能够特异性识别III型B群链球菌
荚膜多糖、III型B群链球菌荚膜多糖结合物及含有III型B群链球菌荚膜多糖的结合疫苗。
[0011]作为对上述方案的进一步描述：所述单克隆抗体由III型B群链球菌荚膜多糖和白喉无毒变异体蛋白(CRM197)结合物免疫小鼠后获得。
[0012]第三方面，本专利技术还提供所述单克隆抗体在检测III型B群链球菌荚膜多糖含量中的应用。
[0013]第四方面，本专利技术还提供含有所述单克隆抗体的检测试剂盒，用于检测III型B群链球菌荚膜多糖含量。
[0014]本专利技术的工作原理如下：本专利技术筛选并保藏了一株能稳定分泌III型B群链球菌荚膜多糖的特异性抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株经传代稳定性实验证明:能稳定地、特异地分泌针对III型B群链球菌荚膜多糖的单克隆抗体。该杂交瘤细胞株通过接种小鼠腹腔，制备得到的腹水型单抗，用蛋白层析法纯化后，纯度高，抗体滴度高，符合后续实验要求，本专利技术运用该单克隆抗体建立的间接竞争ELISA方法，特异性强、灵敏度高，重复性好。所述单克隆抗体特异性地识别III型B群链球菌荚膜多糖、B群链球菌荚膜多糖结合物或者疫苗。不会因为结合疫苗中蛋白的屏蔽效应而造成无法特异性识别的情况，与Ia、Ib、II、IV和V型多糖以及破伤风类毒素(TT)载体、白喉毒素无毒变异体(CRM197)载体均不发生交叉反应；检测灵敏度可达纳克级，提高了检测的灵敏度，且操作简单，特异性强。
[0015]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术可用于B群链球菌荚膜多糖分型诊断以及B群链球菌疫苗和结合疫苗研发过程中III型B群链球菌荚膜多糖的定量检测，特异性强，检测灵敏度可达纳克级，提高了检测的灵敏度，且操作简单。
[0016]本专利技术提供的杂交瘤细胞株保藏信息如下：
[0017]杂交瘤细胞株：
[0018]分类命名为杂交瘤细胞株WV
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GBSIII
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04；
[0019]保藏于中国典型培养物保藏中心；
[0020]保藏编号：CCTCCNO：C202028；
[0021]保藏时间：2020年12月11日；
[0022]保藏地址：中国，武汉，武汉大学。
附图说明
[0023]图1为Elisa的标准曲线图。
具体实施方式
[0024]下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细说明，但本专利技术并不局限于以下技术方案。
[0025]实施例1
[0026]一、小鼠免疫
[0027]免疫抗原：III型B群链球菌荚膜多糖与CRM197结合物原液；
[0028]免疫程序及接种方式：0、14、28天，小鼠腹股沟皮下注射；
[0029]免疫剂量：1ug/只/针次；
[0030]小鼠血清效价检测：采用间接Elisa法；以1ug/ml的III型B群链球菌荚膜多糖为包
被抗原，100ul/孔包被96孔酶标板，2～8℃冰箱过夜；洗板后用5％的脱脂奶粉溶液100ul/孔，37℃封闭1h；洗板后加入梯度稀释的血清，37℃孵育1h；洗板后加入HRP标记羊抗鼠IgG抗体100ul/孔(工作浓度1:10000)，37℃孵育1h；洗板后加入TMB显色液100ul/孔，反应20min；加入0.02mol/L硫酸终止反应，酶标仪OD450nm读数，分析结果。
[0031]选取血清效价较高(通常要求不低于1:10000)的小鼠，于融合前3天加强免疫，抗原为III型B群链球菌荚膜多糖，剂量50ug/0.5ml/只，经腹腔注射。
[0032]二、细胞融合筛选：
[0033]SP2/0细胞准备：
[0034]液氮冻存的SP2/0细胞，经复苏培养，传代至T75瓶，培养2～3天，细胞长满瓶底1层，于融合前1天换液，使细胞处于对数生长期且细胞状态良好。
[0035]融合时用1640培养液将T75瓶的细胞悬浮收集于50ml离心管中，1500rpm/min离心5min，弃上清，细胞用10ml1640重悬后取样计数，备用。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分泌抗III型B群链球菌荚膜多糖单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞命名为WV
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GBSIII
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04，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：C202028，保藏时间2020年12月11日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。2.一种抗III型B群链球菌荚膜多糖的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1中的杂交瘤细胞株分泌。3.如权利要求2所述的抗III型B群链球菌荚...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄镇，钱雯，陈南萍，陈玉秋，吴凯，苏贵超，张胜祥，
申请(专利权)人：玉溪沃森生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：