鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备与应用制造技术

鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备与应用，涉及生物医药。提供鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株A1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No.62532。提供由所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。提供含有所述鼠抗人STC2单克隆抗体的免疫印迹检测试剂、免疫组化及ELISA检测试剂。提供该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在制备免疫印迹检测试剂、免疫组化及ELISA检测试剂中的应用。提供一种免疫印迹检测试剂盒、免疫组化及ELISA检测试剂盒，鼠抗人STC2单克隆抗体应用于蛋白免疫印迹、免疫组化及ELISA检测实验技术。特异性强、灵敏度高。高。高。

【技术实现步骤摘要】
鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备与应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，特别是涉及一种鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备与应用。

技术介绍

[0002]原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，近年来随着各种肝癌治疗手段的广泛应用，肝癌患者的生存率有所提高，早发现、早诊断、早治疗对于改善肝癌患者的预后具有非常重要的意义。
[0003]STC2是在人体各个组织中广泛表达，并且结构高度保守，可通过自分泌或旁分泌的方式发挥作用，是一种分泌性的糖蛋白。研究发现，STC2与肿瘤的发生发展及不良预后密切相关，除乳腺癌外，STC2在大多数的肿瘤组织中起癌蛋白的作用，可帮助肿瘤细胞生长，增强其迁移与侵袭能力，其表达情况也与患者预后相关，高表达的STC2往往预示着较差的预后情况。
[0004]诊断肝癌的技术手段主要集中在影像学技术。超声检查是最早应用于肝癌诊断的技术，但是其优势主要是在肝癌中晚期，在早期诊断中的可靠性较差。斯钙素(stanniocalcin，STC)是一种糖蛋白激素,最早在硬骨鱼中发现,起着调节钙/磷平衡的作用。近年来发现STC2在肝癌、乳腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中具有重要意义。研究表明STC2在多种癌组织中相对于邻近正常组织过表达，其表达与组织学分级和肿瘤进展高度相关。STC2表达的调节改变细胞增殖和上皮间质转化(EMT)。有研究发现血清STC2水平高的HCC患者的总生存率(OS)显著低于STC2水平低的患者，这表明STC2是HCC诊断和预后的有潜力的标志物，在某些方面表现出优于AFP。STC2对原发性肝癌的临床诊断价值为：
⑴
是一种仅次于病理检查的诊断方法；
⑵
为目前最好的早期诊断方法之一；
⑶
及时反应病情变化和治疗效果的敏感指标；(4)帮助患者预测预后情况。
[0005]STC2的检测方法报道很多，比较成熟的是化学发光免疫，酶联免疫吸附(ELISA)、免疫组化等，而这些技术都依赖于优质的STC2抗体。对于STC2单克隆抗体的研制，国内外均有报道，但对其在检测中的特异性及灵敏度的提高尚需进一步研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一目的是克服现有技术的不足，提供特异性好，灵敏度高的一种鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株。
[0007]本专利技术的第二目的在于提供所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。
[0008]本专利技术的第三目的在于提供所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株的应用。
[0009]本专利技术的第四个目的是对所述述鼠抗人STC2单克隆抗体进行初步的表位鉴定。
[0010]本专利技术提供一种鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为杂交
瘤细胞株A1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No.62532，保藏日期：2022年06月13日。
[0011]本专利技术提供由所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
[0012]本专利技术提供一种提供含有所述鼠抗人STC2单克隆抗体的免疫印迹检测试剂。
[0013]本专利技术提供一种提供含有所述鼠抗人STC2单克隆抗体的免疫组化检测试剂。
[0014]本专利技术提供一种提供含有所述鼠抗人STC2单克隆抗体的ELISA检测试剂。
[0015]本专利技术提供所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在制备免疫印迹检测试剂中的应用。
[0016]一种免疫印迹检测、免疫组化及ELISA检测试剂盒，包含所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
[0017]所述鼠抗人STC2单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0018]1)单克隆抗体的腹水生产：
[0019]选用SPF级，7～9周龄小鼠，采用腹腔注射的方式，对每只小鼠注射500μL的高温灭菌的液体石蜡，一周后，将单克隆细胞株用PBS吹落离心，重悬后调整细胞密度，每只小鼠腹腔接种500μL，106个杂交瘤细胞株，待7～14天左右观察小鼠腹部肿大情况，用注射器反复收集2～3次腹水，7000rpm,离心20min，吸取中部淡黄色液体备用；
[0020]2)抗体纯化：
[0021]将所得腹水用结合缓冲液稀释一倍后，与预处理过的proteinG在低温实验室过夜孵育，2500rpm,离心3min后弃去上清，洗杂两次后，用洗脱缓冲液洗脱，收集洗杂与洗脱组分，SDS
‑
PAGE电泳后，用考马斯亮蓝染色，判断抗体纯度与浓度。
[0022]本专利技术的优点：
[0023]本专利技术公开一种肝癌诊断的生物标志物及其单克隆抗体制备的方法，该生物标志物为STC2蛋白，可用于肝癌的早期筛查，及预后情况预测。其主要内容包括制备STC2抗原；制备杂交瘤细胞株；制备STC2单克隆抗体；抗体性质验证。鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌抗体效价高，特异性强，灵敏度高，易于检测，可在肝癌的早期检测药物、试剂中应用，也可用于后续的双抗夹心ELISA试剂盒的研制。试验验证，本专利技术的杂交瘤细胞产生的鼠抗人STC2单克隆抗体可应用于蛋白免疫印迹实验、免疫组化和ELISA检测技术中。且特异性强、灵敏度高。
附图说明
[0024]图1为STC2重组蛋白小量表达考马斯亮蓝染色结果。将诱导前及诱导后的大肠杆菌裂解后，分别上样进行10％的SDS
‑
PAGE电泳分离蛋白，后经考马斯亮蓝染色，可见35KD处诱导后有明显外源蛋白表达条带。
[0025]图2为his标签的STC2重组蛋白经变性后，使用Ni柱纯化后采用咪唑进行梯度洗脱的考马斯亮蓝染色结果。洗脱浓度分别为：0mM、50mM、100mM、250mM。
[0026]图3为变性重组蛋白，使用透析方式梯度去除尿素后，再经超滤浓缩后，采用BSA梯度浓度的方式测定蛋白浓度的考马斯亮蓝染色结果。
[0027]图4为his标签的重组蛋白，westernblot验证结果。
[0028]图5为细胞融合之后，经HAT选择性培养基筛选、ELISA初次筛选及三次亚克隆化过
程中的ELISA筛选结果。结果显示，其阳性为100％，能够稳定分泌STC2抗体。
[0029]图6为小鼠体内制备抗体及其纯化结果图，从左到右依次为纯化前腹水、洗杂组分、洗脱组分、BSA梯度浓度。
[0030]图7为单克隆抗体亚型鉴定结果。按照抗体分型试剂盒操作方法，鉴定所得抗体亚型，最终确定此STC2单克隆抗体亚型为IgG1。
[0031]图8为western blot鉴定结果，结果显示抗体特异性较好，无明显杂带。
[0032]图9为识别表位鉴定结果，初步显示抗体可识别STC2后100个氨基酸中的特异性位点。
[0033]图10为免疫组化鉴定结果，结果显示抗体可以检测人肝癌组织中的STC2的表达。
[0034]图11为ELIS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株A1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No.62532，保藏日期：2022年06月13日。2.如权利要求1所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。3.如权利要求1所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在制备免疫印迹检测试剂中的应用。4.一种免疫印迹检测试剂盒，其特征在于包含如权利要求2所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。5.一种免疫组化检测试剂盒，其特征在于包含如权利要求2所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。6.一种ELISA检测试剂盒，其特征在于包含如权利要求2所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。7.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾锦章，高金国，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：