一种富硒灵芝天然活性蛋白的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种富硒灵芝天然活性蛋白的提取方法，本发明专利技术通过向灵芝菌丝体富硒发酵液蛋白质粗提产物水溶液中添加经过预处理的酶复合物，经过特定的处理程序，再次提取处理液中的蛋白质，第二次提取得到的产物中蛋白质含量有很大幅度增加，其中以淀粉酶、木聚糖酶为代表的活性蛋白的活性保留在80％以上。为代表的活性蛋白的活性保留在80％以上。

【技术实现步骤摘要】
一种富硒灵芝天然活性蛋白的提取方法


[0001]本专利技术涉及一种富硒灵芝天然活性蛋白的提取方法，属于提取纯化


技术介绍

[0002]灵芝(Ganoderma)是我国传统的保健型食用真菌。在食用真菌中，灵芝对硒的耐受力较强，是获得富硒食品的一种比较理想的真菌。硒进入生物体后可以以不同的形式存在，其中以生物有机分子组成成分的形式存在的的硒元素被称为有机硒。在有机硒中，含硒蛋白是重要而又研究得相对比较清楚的一类含硒分子。硒在蛋白质中有很大一部分是以硫元素替代物存在于氨基酸残基中，比较重要的有硒代甲硫氨酸和硒代半胱氨酸。硒代甲硫氨酸是一种比较稳定的分子，而硒代半胱氨酸容易发生进一步反应，例如硒元素有可能以离子形式离开氨基酸，因而失去生物学活性。在蛋白分子中，硒代半胱氨酸中的硒需要有两个分子形成硒代胱氨酸，即形成蛋白分子内的二硒键的形式才能稳定存在。硒代半胱氨酸中硒元素是硫元素的替代物，因此二硒键也具有二硫键的功能。二硫键是蛋白质形成和维持高级结构的最重要的结构，含有二硫键的蛋白在二硫键断裂后一般都会因结构变化而失去活性。与之相对，一个蛋白如果能维持其生物活性则也能基本判断其二硫键是稳定的。
[0003]菌丝体发酵是获得灵芝多糖的一个重要方法，本专利技术前期研究发现灵芝菌丝体发酵获得的培养液中，除含有大量的胞外多糖也含有大量的蛋白质，如能把这些蛋白提取出来则可以是获得含硒蛋白的一个有效的途径。灵芝菌丝体发酵液中，蛋白质是和大量的胞外多糖混杂在一起，蛋白质提取时往往会带出大量的灵芝多糖，因而很难得到纯度高的胞外蛋白。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种从富硒灵芝发酵液中提取较高纯度蛋白质，并较大幅度提高具有天然活性的蛋白的含量的方法，通过向灵芝菌丝体富硒发酵液蛋白质粗提产物水溶液中添加经过预处理的酶复合物，经过特定的处理程序，再次提取处理液中的蛋白质，第二次提取得到的产物中蛋白质含量有很大幅度增加，其中以淀粉酶、木聚糖酶为代表的活性蛋白的活性保留在80％以上。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种富硒灵芝天然活性蛋白的提取方法，包括如下步骤：
[0006]S1、将灵芝菌丝体发酵后的发酵液离心，获得上清液，将获得的上清液进行盐析和脱盐处理，得到粗蛋白溶液；
[0007]S2、向粗蛋白溶液中加入溶液105，混合后加入复合葡聚糖酶D溶液进行酶解处理，处理后进行盐析、脱盐，得到所述的富硒灵芝天然活性蛋白；
[0008]其中，所述的溶液105由50mM～100mM磷酸氢二钠
‑
磷酸二氢钾，5％～10％酒精和1％～2％PEG
‑
200组成；
[0009]所述的复合葡聚糖酶D溶液通过如下方法制备得到：将葡聚糖酶BglA、葡聚糖酶
AnEglA6和纤维素酶按照酶活比为0.5～1.5:0.5～1.5:1混合，得到复合葡聚糖酶A溶液，加入复合葡聚糖酶A溶液5～15％体积的处理液T312，在40～50℃处理10～30min，冷却并调整pH为3.5～4.5，得到复合葡聚糖酶D溶液；
[0010]其中，处理液T312通过如下方法制备：将含有1％～2％PEG
‑
200、0.001％～0.002％聚乙二醇辛基苯基醚、0.05g/L～0.07g/L CoCl3和0.01g/L～0.02g/L ZnCl2的溶液的pH调至7.5～8.5，保持1.5～2.5h后，将pH调至9.0～9.5，并在
‑
5～5℃保持20～30h。
[0011]本专利技术处理液T312中，PEG
‑
200和聚乙二醇辛基苯基醚含量按体积比计。
[0012]进一步地，在复合葡聚糖酶A溶液中，葡聚糖酶BglA的酶活为400U/mL～600U/mL。
[0013]进一步地，所述的冷却是在冰水浴中进行冷却。
[0014]进一步地，所述的盐析是通过加入硫酸铵进行盐析。
[0015]进一步地，所述的脱盐是采用截留分子量为2.5～3.5KD超滤膜处理2～4次。
[0016]进一步地，S2步骤中，酶解处理是在38～42℃处理0.5～2h。
[0017]进一步地，S2步骤中，酶解处理后，包括调节pH为3.5～4.5，在25～35℃保温处理4～6h。
[0018]进一步地，灵芝菌丝体发酵是在28～32℃、160～200r/min培养5～10天。
[0019]进一步地，S1步骤中，离心是10,000～14,000r/min离心5～10min。
[0020]本专利技术的第二个目的是提供所述方法制备得到的富硒灵芝天然活性蛋白。
[0021]本专利技术的有益效果是：
[0022]本专利技术通过向灵芝菌丝体富硒发酵液蛋白质粗提产物水溶液中添加经过预处理的酶复合物，经过特定的处理程序，再次提取处理液中的蛋白质，第二次提取得到的产物中蛋白质含量有很大幅度增加，其中以淀粉酶、木聚糖酶为代表的活性蛋白的活性保留在80％以上。
具体实施方式
[0023]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0024]粗蛋白的制取方法：
[0025]按方法1的方法制备灵芝菌丝体富硒发酵液，发酵结束后发酵液12,000r/min离心5min，取上清液。按方法2盐析法提取发酵液的上清液，进一步再用方法3进行脱盐，由此获得粗蛋白溶液。粗蛋白中蛋白质的含量一般在40％左右。
[0026]再制蛋白的制取方法：
[0027]本专利技术建立的处理粗蛋白溶液的方法：在上述粗蛋白溶液中加入溶液105，混合后加入复合葡聚糖酶D溶液，在40摄氏度保温1h。反应结束后用盐酸调整pH至4.0。30℃保温5h。反应液用硫酸铵盐析法获得蛋白质沉淀，沉淀用水溶解后用超滤管进行脱盐。脱盐获得的为再制蛋白溶液，计算再制蛋白中蛋白质的含量。通过上述方法处理，再制蛋白中蛋白质的含量一般在75％左右，淀粉酶总酶活和木聚糖酶总酶活均维持在粗酶液的80％以上。
[0028]上述溶液105的组成：50mM磷酸氢二钠
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磷酸二氢钾，10％酒精，1％PEG
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200。
[0029]上述复合葡聚糖酶溶液的制备方法如下：取适当稀释获得的1000U/mL葡聚糖酶BglA和1000U/mL的AnEglA6，等体积混合，加入纤维素酶固体粉末，添加至终浓度为500U/
mL。上述溶液称为复合葡聚糖酶A溶液，简称复配酶A。制备复合葡聚糖酶D溶液时，在上述复合葡聚糖酶A溶液复配完成后迅速放入冰水混合物中，轻轻摇动迅速降温。加入十分之一体积的溶液T312。升温至45摄氏度，维持20min。迅速放入冰水中，用盐酸调整pH为4.0。经过上述处理的酶液称为复合葡聚糖酶D溶液，简称复配酶D。其中T312的成分如下：1％体积比的PEG200，0.001％体积比的聚乙二醇辛基苯基醚，0.0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种富硒灵芝天然活性蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将灵芝菌丝体发酵后的发酵液离心，获得上清液，将获得的上清液进行盐析和脱盐处理，得到粗蛋白溶液；S2、向粗蛋白溶液中加入溶液105，混合后加入复合葡聚糖酶D溶液进行酶解处理，处理后进行盐析、脱盐，得到所述的富硒灵芝天然活性蛋白；其中，所述的溶液105由50mM～100mM磷酸氢二钠
‑
磷酸二氢钾，5％～10％酒精和1％～2％PEG
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200组成；所述的复合葡聚糖酶D溶液通过如下方法制备得到：将葡聚糖酶BglA、葡聚糖酶AnEglA6和纤维素酶按照酶活比为0.5～1.5:0.5～1.5:1混合，得到复合葡聚糖酶A溶液，加入复合葡聚糖酶A溶液5～15％体积的处理液T312，在40～50℃处理10～30min，冷却并调整pH为3.5～4.5，得到复合葡聚糖酶D溶液；其中，处理液T312通过如下方法制备：将含有1％～2％PEG
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200、0.001％～0.002％聚乙二醇辛基苯基醚、0.05g/L～0.07g/L C℃l3和0.01g/L～0.02g/L ZnCl2的溶液的pH调至7.5～8.5，保持1....

【专利技术属性】
技术研发人员：韩景，郭仁妹，韩峰，王乐锦，
申请(专利权)人：苏州微克生活科技有限公司，
类型：发明
国别省市：