一种利用水凝胶调控提高蛋白质结晶效率的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用水凝胶调控提高蛋白质结晶效率的方法，该方法包括以下步骤：将单体混合得到预聚液后，加入水、光引发剂，搅拌后得到水凝胶前驱体溶液，将所得水凝胶前驱体溶液稳定后，进行紫外光照射，得到水凝胶粗体，将所得水凝胶粗体在水中浸泡后干燥，得到干燥水凝胶；配制缓冲液，使用所得缓冲液制备沉淀剂；用所得沉淀剂浸泡步骤所得干燥水凝胶，使所得干燥水凝胶溶胀，洗涤后干燥，得到目标水凝胶；将蛋白质溶解在所得缓冲液中，得到蛋白质溶液；将所得蛋白质溶液滴加在所得目标水凝胶的表面上进行结晶，得到蛋白质晶体。与现有技术相比，本发明专利技术可以有效解决蛋白质结晶存在的效率低下的问题，同时能够保证蛋白质结晶质量。同时能够保证蛋白质结晶质量。同时能够保证蛋白质结晶质量。

【技术实现步骤摘要】
一种利用水凝胶调控提高蛋白质结晶效率的方法


[0001]本专利技术涉及蛋白质结晶方法
，尤其是涉及一种利用水凝胶调控提高蛋白质结晶效率的方法。

技术介绍

[0002]蛋白质是生命活动的物质基础，而阐明其三维结构能够理解生命活动的基本机制，这也是其功能研究的前提和基础。单晶X射线衍射是测定蛋白质三维结构的最为成熟和有效的技术，而这种技术依赖于高质量蛋白质晶体的可获取性。此外，蛋白质晶体的也在蛋白质纯化、生物传感和药物递送等领域具有广泛的应用。然而，蛋白质结晶效率低下和晶体质量不佳制约了蛋白质结构的解析和相关的应用，是目前亟待解决的关键问题。
[0003]由于蛋白质分子具有分子量大、空间结构复杂及表面带电性等特点，使得蛋白质结晶困难，因此需要通过调节沉淀剂浓度来调控蛋白质溶液过饱和度至特定区间、并有效诱导成核过程。蛋白质结晶过程主要依赖于溶液过饱和度的调控和成核过程的诱导。这是因为，低过饱和度下，蛋白质分子无法形成成核前的亚稳态团簇；高过饱和度下，蛋白质分子由于过快、过度的聚集而形成无定型沉淀。公开号为CN105254706的专利技术专利申请公开了一种利用超疏水表面结晶蛋白质的方法，采用超疏水界面作为蛋白质结晶界面，在密闭容器中缓慢蒸发，形成溶液过饱和度以促进蛋白质结晶，但该方法中溶液过饱和度通过随机性的蒸发过程控制，蛋白质结晶过程速度缓慢且不可控；并且蛋白质结晶时间较长，结晶效率较低。
[0004]水凝胶由于具有良好的生物相容性和独特的表面及空间结构，近年来被逐渐应用于蛋白质结晶领域。当前，国内外对水凝胶体系调控蛋白质结晶过程的研究仍处于起步阶段。Profio等(Profio G D,Polino M,Nicoletta F P,et al.Tailored hydrogel membranes for efficient protein crystallization[J].Advanced Functional Materials,2014,24(11):1582
‑
1590.)利用水凝胶表面结构和凝胶内部结构来进行蛋白质结晶调控，将溶菌酶溶液滴加在水凝胶表面后加入等体积的沉淀剂，形成混合液滴，将混合液滴置于悬滴板中进行结晶，得到溶菌酶晶体。这种方法能够提供蛋白质成核位点并诱导成核，但因其缺乏主动性的溶液过饱和度调控手段，需要依靠前期对沉淀剂浓度的大量筛选来确定过饱和度区间，此外，采用这种方法进行蛋白质结晶，溶菌酶的结晶时间长达48h，存在效率低下的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种利用水凝胶调控提高蛋白质结晶效率的方法，可以有效解决蛋白质结晶存在的效率低下的问题，同时能够保证蛋白质结晶质量。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0007]本专利技术的目的是提供一种利用水凝胶调控提高蛋白质结晶效率的方法，包括如下
步骤：
[0008]S1、将聚乙二醇二丙烯酸酯和N,N
‑
二甲基丙烯酰胺混合得到预聚液，向所得预聚液中加入水、光引发剂，搅拌后得到水凝胶前驱体溶液，将所得水凝胶前驱体溶液稳定后，进行紫外光照射，得到水凝胶粗体，将所得水凝胶粗体在水中浸泡后干燥，得到干燥水凝胶；
[0009]S2、配制缓冲液，使用所得缓冲液制备沉淀剂；
[0010]S3、用步骤S2所得沉淀剂浸泡步骤S1中所得干燥水凝胶，使S1中所得干燥水凝胶溶胀，洗涤后干燥，得到目标水凝胶；
[0011]S4、将蛋白质溶解在步骤S2所得缓冲液中，得到蛋白质溶液；
[0012]S5、将步骤S4所得蛋白质溶液滴加在步骤S3所得目标水凝胶的表面上进行结晶，得到蛋白质晶体。
[0013]进一步地，步骤S1中所述聚乙二醇二丙烯酸酯的分子量为200
‑
1000。
[0014]选用聚乙二醇二丙烯酸酯作为单体的原因如下：经过FDA认证，聚乙二醇二丙烯酸酯具有生物相容性，无毒。
[0015]进一步地，步骤S1中所述光引发剂为2
‑
羟基
‑2‑
甲基
‑1‑
苯基
‑1‑
丙酮(HMPP)、2
‑
甲基
‑1‑
(4
‑
甲硫基苯基)
‑2‑
吗啉基
‑1‑
丙酮、四甲基乙二胺(TEMED)中的一种或多种的组合。
[0016]进一步优选地，所述光引发剂为2
‑
羟基
‑2‑
甲基
‑1‑
苯基
‑1‑
丙酮(HMPP)。
[0017]进一步地优选地，步骤S1中所述光引发剂为2
‑
羟基
‑2‑
甲基
‑1‑
苯基
‑1‑
丙酮。
[0018]进一步优选地，步骤S1中所述水为超纯水。
[0019]进一步地，步骤S1中所述聚乙二醇二丙烯酸酯和N,N
‑
二甲基丙烯酰胺的质量比为5:1～10:1，在此范围之内，能够形成特殊结构的水凝胶来调控蛋白质溶液的过饱和度；所述预聚液与水的质量比为1:10～1:20；所述光引发剂在所述水凝胶前驱体溶液中的质量分数为0.5～1.5％。
[0020]进一步地，步骤S1中所述搅拌采用的搅拌速率为100～500rpm，搅拌时间为0.5～2h。
[0021]进一步优选地，步骤S1中所述搅拌的搅拌速率为200～400rpm，搅拌时间为1h。
[0022]进一步地，步骤S1中所述稳定的条件为在在氮气气氛下稳定0.5～1h。
[0023]进一步地，步骤S1中所述紫外光照射中采用的紫外光波长为365nm，照射时间为10～20min。
[0024]进一步地，步骤S2中所述缓冲液为醋酸钠溶液；所述醋酸钠溶液的浓度为0.1～0.2M，pH为4～5，所述缓冲液能够减少体系内pH变动并维持溶液体系酸碱度。
[0025]进一步地，步骤S2中所述沉淀剂包括所述缓冲液和氯化钠；所述氯化钠在所述沉淀剂中的浓度为1～2M。
[0026]进一步地，步骤S3中所述浸泡的浸泡时间为6～12h。
[0027]进一步优选地，步骤S4中所述蛋白质为溶菌酶。
[0028]进一步地，步骤S4中所述蛋白质溶液中蛋白质的浓度为10～50mg/mL。
[0029]进一步地，步骤S5中所述结晶的温度为20～30℃。
[0030]进一步，步骤S5中所述结晶在密封的结晶容器中进行。
[0031]进一步优选地，所述结晶容器为培养皿。
[0032]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0033]1)本专利技术提供的利用水凝胶调控提高蛋白质结晶效率的方法，通过水凝胶调控蛋白质溶液的过饱和度，晶体完全生长时间控制在60min以内，极大提高了结晶效率。
[0034]2)本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用水凝胶调控提高蛋白质结晶效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将聚乙二醇二丙烯酸酯和N,N
‑
二甲基丙烯酰胺混合得到预聚液，向所得预聚液中加入水、光引发剂，搅拌后得到水凝胶前驱体溶液，将所得水凝胶前驱体溶液稳定后，进行紫外光照射，得到水凝胶粗体，将所得水凝胶粗体在水中浸泡后干燥，得到干燥水凝胶；S2、配制缓冲液，使用所得缓冲液制备沉淀剂；S3、用步骤S2所得沉淀剂浸泡步骤S1中所得干燥水凝胶，使S1中所得干燥水凝胶溶胀，洗涤后干燥，得到目标水凝胶；S4、将蛋白质溶解在步骤S2所得缓冲液中，得到蛋白质溶液；S5、将步骤S4所得蛋白质溶液滴加在步骤S3所得目标水凝胶的表面上进行结晶，得到蛋白质晶体。2.根据权利要求1所述的一种利用水凝胶调控提高蛋白质结晶效率的方法，其特征在于，步骤S1中所述聚乙二醇二丙烯酸酯的分子量为200
‑
1000；所述光引发剂为2
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羟基
‑2‑
甲基
‑1‑
苯基
‑1‑
丙酮、2
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甲基
‑1‑
(4
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甲硫基苯基)
‑2‑
吗啉基
‑1‑
丙酮、四甲基乙二胺中的一种或多种的组合。3.根据权利要求1所述的一种利用水凝胶调控提高蛋白质结晶效率的方法，其特征在于，步骤S1中所述聚乙二醇二丙烯...

【专利技术属性】
技术研发人员：张相洋，严一振，袁渭康，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：