一种去除变性蛋白的方法技术

本发明专利技术申请涉及一种去除变性蛋白的方法，在特定时间点降低变性蛋白溶液的pH值至7.0以下，并在合适温度下温育所述变性蛋白溶液预定时间；所述特定时间点为所述变性蛋白溶液处于包含无活性蛋白的时间点。本发明专利技术提供的去除变性蛋白的方法通过降低变性蛋白溶液的pH值，使其呈现一定的酸度，在较低温度下就可以实现快速去除变性蛋白的目的，并且能够方便地应用于大批量的变性蛋白去除的生物工程作业中。大批量的变性蛋白去除的生物工程作业中。大批量的变性蛋白去除的生物工程作业中。

【技术实现步骤摘要】
一种去除变性蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及制备重组蛋白的生物技术，具体涉及一种去除变性蛋白的方法。

技术介绍

[0002]基因工程技术用于目的蛋白的表达体系有多种，其中大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统。大肠杆菌由于遗传背景相对清楚，使用安全，易操作，表达量大，生产成本低和周期短，以及有大量可供选择的克隆或表达载体，使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株。一般在大肠杆菌表达的蛋白产量很高，但是在细胞内聚集的重组蛋白通常以包涵体形式存在，形成一些缺乏生物学活性、错误折叠的不溶聚合物。现在我们已经知道包涵体中的变性蛋白具有与活性蛋白相同的一级结构，其缺乏生物学活性，是由于错误折叠而没有形成正确的高级结构所导致的。
[0003]蛋白质的高级结构由一级结构决定的学说最初是由Anfinsen于1954年提出的，这也是后来大家熟知的变性蛋白重折叠获得活性蛋白的理论基础。尽管Anfinsen的工作奠定了蛋白质折叠的热力学基础，他也因此获得了1972年的诺贝尔化学奖，但是蛋白质折叠是相当复杂的。到现在为止，我们仍然不能根据一个蛋白质的一级结构推断出它的三维结构。同时，还必须注意到，蛋白质在体外的折叠比在细胞内的折叠要慢得多。
[0004]变性蛋白的重折叠通常包括以下步骤：包涵体的分离、溶解、复性。包涵体的溶解通常使用的变性剂是盐酸胍和尿素，也有些使用表面活性剂如SDS溶解变性蛋白，前者可以统称为离液剂。溶解后的蛋白必须经过复性才有活性，那么就要除去变性剂使得蛋白折叠以及形成正确的分子内交联，复性是包涵体纯化流程中最为关键的一步。复性成功的秘诀在于促进主要途径而抑制导致聚集体形成的途径，但是怎样实现目前尚不十分清楚。复性通常是非常困难而且费时的，原因是蛋白本身差异巨大，导致蛋白重折叠效率完全不同。我们很多数据表明即使是同种蛋白的少数几个氨基酸变动都可能导致蛋白重折叠数据相差甚远。
[0005]复性之后的混合物溶液成分是复杂的，目前我们的实验数据与现有研究成果都表明，其成分包括：沉淀、可溶性多聚体、二聚体、活性单体及无活性单体。不同的重折叠环境下，这些成分的浓度也是不同的，我们的数据表明通常情况下混合物溶液中的主要成分为相邻两种成分的混合物，其它成分相对较少。总之，蛋白重折叠后的溶液并不是单一的活性单体，混合物溶液中不可避免的存在部分或者大量变性蛋白组成的沉淀、可溶性多聚体及无活性单体等。为了获得单一的有活性的蛋白，必须去除由这些变性蛋白组成的沉淀、可溶性多聚体及无活性单体。
[0006]现有的技术中，去除这些变性蛋白组成的沉淀、可溶性多聚体及无活性单体的技术包括：透析或者超滤类似的技术、室温或者37℃放置加速沉淀。其中，透析或者超滤类似的技术是通过将离液剂去除到一个很低的浓度从而使变性蛋白沉淀，进一步离心后去除变性蛋白，其缺点是无法大批量使用；室温或者37℃放置加速沉淀的技术最大的问题是很多情况下不适用，因为复性溶液中通常具有高浓度离液剂，通常是0.5
‑
2M尿素，这种情况下37
℃放置很难将变性蛋白聚集沉淀，而且很多蛋白属于非耐热蛋白，37℃长时间放置会导致复性的蛋白质变性。

技术实现思路

[0007]基于此，有必要针对上述提到的至少一个问题，提供一种去除变性蛋白的方法。
[0008]本申请提供的一种去除变性蛋白的方法，在特定时间点降低变性蛋白溶液的pH值至7.0以下，并在合适温度下温育所述变性蛋白溶液预定时间，所述合适温度为2℃
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37℃或更高，所述预定时间为10min以上；
[0009]所述特定时间点为所述变性蛋白溶液处于包含无活性蛋白的时间点。
[0010]在其中一个实施例中，所述特定时间点为所述无活性蛋白位于生物反应器及单元操作容器中的时间点。
[0011]在其中一个实施例中，所述无活性蛋白为沉淀、无活性可溶性多聚体、无活性二聚体或无活性单体中的任意一种或多种。
[0012]在其中一个实施例中，所述特定时间点降低变性蛋白溶液的pH值至7.0以下的步骤包括往所述变性蛋白溶液中加入酸性溶液。
[0013]在其中一个实施例中，所述酸性溶液包括酸碱缓冲液、强酸、中强酸和弱酸中的任意一种或多种；所述酸碱缓冲液的pH值缓冲范围为7.0以下。
[0014]在其中一个实施例中，所述酸碱缓冲液为磷酸二氢钾。
[0015]在其中一个实施例中，所述特定时间点降低变性蛋白溶液的pH值至7.0以下的步骤包括改变所述变性蛋白溶液温度。
[0016]在其中一个实施例中，所述改变所述变性蛋白溶液温度为升高所述变性蛋白溶液的温度。
[0017]在其中一个实施例中，所述在特定时间点降低变性蛋白溶液的pH值至7.0以下的步骤为降低所述变性蛋白溶液的pH值至4.0
‑
6.8。
[0018]本专利技术的实施例中提供的技术方案带来如下有益技术效果：
[0019]本专利技术提供的去除变性蛋白的方法通过降低变性蛋白溶液的pH值，使其呈现一定的酸度，在较低温度下就可以实现快速去除变性蛋白的目的，并且能够方便地应用于大批量的变性蛋白去除的生物工业生产作业。
[0020]本申请附加的方面和优点将在后续部分中给出，并将从后续的描述中详细得到理解，或通过对本专利技术的具体实施了解到。
附图说明
[0021]图1为多组鸡干扰素α复性前处理及复性后酸处理去除变性蛋白并纯化后电泳分析结果图，其中
[0022]Lane M:maker；
[0023]Lane 1：未诱导表达鸡干扰素α样品；
[0024]Lane 2：诱导表达鸡干扰素α样品；
[0025]Lane 3：鸡干扰素α样品裂解后沉淀样品；
[0026]Lane 4:鸡干扰素α样品裂解后上清样品；
[0027]Lane 5:尿素洗涤包涵体离心沉淀样品；
[0028]Lane 6:尿素洗涤包涵体离心上清样品；
[0029]Lane 7：尿素溶解的变性鸡干扰素α样品；
[0030]Lane 8：鸡干扰素α复性后酸处理去除变性蛋白并纯化的样品非变性电泳。
[0031]图2为不同程度酸处理对变性蛋白沉淀速率的影响对比图，图中，从左往右依次为对照组(pH8.0)、实验组1(pH6.8)及实验组2(pH4.0)。
[0032]图3为不同程度酸处理对变性蛋白沉淀量的电泳分析，其中
[0033]Lane M:maker；
[0034]Lane 1：对照组(pH8.0)沉淀电泳分析；
[0035]Lane2：实验组1(pH6.8)沉淀电泳分析；
[0036]Lane3：实验组2(pH4.0)沉淀电泳分析。
具体实施方式
[0037]为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的可能的实施例的结果。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文已经通过附图描述的实施例。通过参考本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种去除变性蛋白的方法，其特征在于，在特定时间点降低变性蛋白溶液的pH值至7.0以下，并在合适温度下温育所述变性蛋白溶液预定时间，所述合适温度为2℃
‑
37℃或更高，所述预定时间为10min以上；所述特定时间点为所述变性蛋白溶液处于包含无活性蛋白的时间点。2.根据权利要求1所述的去除变性蛋白的方法，其特征在于，所述特定时间点为所述无活性蛋白位于生物反应器及单元操作容器中的时间点。3.根据权利要求1所述的去除变性蛋白的方法，其特征在于，所述无活性蛋白为沉淀、无活性可溶性多聚体、无活性二聚体或无活性单体中的任意一种或多种。4.根据权利要求1所述的去除变性蛋白的方法，其特征在于，所述特定时间点降低变性蛋白溶液的pH值至7.0以下的步骤包括往所述变性蛋白溶液中加入酸性溶液。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：孙国平，周杰，王建中，贾佳，梁信，吴美娟，刘俊，林丽，
申请(专利权)人：佛山市顺德区博大生物科技有限公司西藏金草新绿生态发展有限公司西藏金草生态修复产业研究中心有限合伙黄石市畜牧兽医局市防治重大动物疫病指挥部办公室，市动物卫生监督局，
类型：发明
国别省市：