一株高产α-半乳糖苷酶的黑曲霉诱变菌株及其选育方法和应用技术

本发明专利技术属于微生物发酵和酶催化水解技术领域，具体涉及一株高产α

【技术实现步骤摘要】
一株高产
α
‑
半乳糖苷酶的黑曲霉诱变菌株及其选育方法和应用


[0001]本专利技术属于微生物发酵和酶催化水解
，具体涉及一株高产α
‑
半乳糖苷酶的黑曲霉诱变菌株及其选育方法和应用。

技术介绍

[0002]α
‑
半乳糖苷酶属于外切糖苷酶类，具有较强的水解能力，能水解棉子糖家族寡糖，其广泛存在于微生物、植物和动物中。α
‑
半乳糖苷酶在食品、饲料工业中，该酶可作为一种外源添加酶，从而消除豆类食品和饲料中由α
‑
半乳糖苷类物质引起的抗营养作用。出于从经济方面考虑，如今一部分研究在现有菌种的基础上利用成本低的农副产品为发酵基质来生产α
‑
半乳糖苷酶，而另一部分研究则致力于改良菌种。具有高活性的α
‑
半乳糖苷酶生产菌的选育以及获得优良的水解能力是目前所亟需的。

技术实现思路

[0003]为了解决α
‑
半乳糖苷酶活性低，产量少的问题，本专利技术旨在获得一株高产α
‑
半乳糖苷酶的黑曲霉诱变菌株，以提高该酶在工业生产中的应用潜能。采用紫外线(UV)
‑
硫酸二乙酯(DES)复合诱变技术处理原始出发菌株黑曲霉，筛选出一株高产α
‑
半乳糖苷酶的黑曲霉诱变菌株。该菌株所产的α
‑
半乳糖苷酶活性高于原始菌株，在最佳固态发酵条件下能显示出较高的酶活，提高了生产效益，此外还具有良好的水解性能，在食品、饲料工业具有极为广阔的应用前景。
[0004]主要工艺路线：以黑曲霉菌株Aspergillus sp.C18为初始菌株，通过紫外线和硫酸二乙酯复合诱变手段对菌株进行诱变，最终筛选得到α
‑
半乳糖苷酶酶活高的目的菌株，该菌株分类学命名为Aspergillus sp.D
‑
23，保藏号为CGMCC No.40330，已于2022年10月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0005]本专利技术中的原始出发菌株为本实验室保藏的黑曲霉菌株Aspergillus sp.C18.
[0006]具体选育方法包括如下步骤：
[0007](1)将黑曲霉菌株活化培养在PDA固体培养基上，培养3天，用无菌生理盐水将黑曲霉孢子洗脱下来，置于已灭菌的含有玻璃珠的离心管中，充分震荡，将孢子打散，取无菌纱布过滤孢子悬液，利用血球计数板，计算孢子个数，并取生理盐水进行稀释，使孢子浓度为1
×
106个/mL。
[0008]其中，PDA固体培养基成分：土豆20％，葡萄糖2％，琼脂2％，加水定容至100mL，115℃灭菌30min。
[0009](2)将步骤(1)所得孢子悬液在15W的紫外灯下垂直照射30cm处，在搅拌状态下，分别照射1、2、3、4、5、6、7、8、9、10min，各取1mL于装有无菌生理盐水的试管中，梯度稀释至103，取100μL涂布于初筛培养基上，避光培养48h。
[0010]其中，初筛筛选培养基成分：葡萄糖2％，KNO
3 0.3％，K2HPO
4 0.1％，MgSO4·
7H2O 0.05％，KCl 0.05％，FeSO4·
7H2O 0.001％，琼脂2％，加水定容至100mL，pH 6.5，X
‑
α
‑
Gal 100μL，115℃灭菌30min。
[0011]X
‑
α
‑
Gal溶液配制方法：取4mg X
‑
α
‑
Gal溶于1mL DMF中，避光保存在
‑
20℃；
[0012]X
‑
α
‑
Gal溶液的使用方法：倾倒平板后，取100μL经0.22μm无菌过滤器除菌的X
‑
α
‑
Gal溶液，涂布于平板上。
[0013](3)将步骤(2)中初筛培养基上显蓝色的单菌落挑选出，接种到液体PDA培养基中，28℃，培养2d；再接种于固态发酵培养基中，以未诱变的初始菌株为对照，28℃，培养5d，测α
‑
半乳糖苷酶的酶活，选择酶活高的菌株为下一步化学诱变的出发菌株。
[0014]其中，液体PDA培养基成分：土豆20％，葡萄糖2％，加水定容至100mL，115℃灭菌30min。
[0015]发酵培养基配方：麸皮32％，蛋白胨2％，(NH4)2SO
4 2.8％，FeSO4·
7H2O 0.2％，含水量60％，pH6.0，121℃灭菌20min。
[0016](4)将步骤(3)中复筛发酵所得酶活最高的紫外诱变菌株制成孢子悬液，取硫酸二乙酯和95％乙醇制成不同浓度的DES溶液(v/v:10％、20％、30％、40％和50％)，将不同浓度的DES溶液与孢子悬液按体积比(DES/孢子悬液)1％混合，在28℃振荡处理20、40、60、90、120、150、180、210min，加入0.5mol/L硫代硫酸钠溶液2mL终止反应；各取1mL于装有无菌生理盐水的试管中，梯度稀释至103，取100μL涂布于初筛培养基上，避光培养48h。
[0017]其中，0.5mol/L硫代硫酸钠溶液：0.124g/mL硫代硫酸钠，0.45μm无菌过滤器除菌。
[0018](5)对化学诱变后的菌株进行复筛，复筛方法同上述步骤(3)。
[0019]本专利技术还对筛选出的一株高产α
‑
半乳糖苷酶的黑曲霉诱变菌株进行进一步固态发酵：从诱变育种得到的黑曲霉诱变菌株Aspergillus sp.D
‑
23出发，对其产α
‑
半乳糖苷酶的固态发酵进行优化。
[0020]固态发酵培养基成分如下：以麸皮为固体基质，以豆粕、蛋白胨、酵母粉、硫酸钠、柠檬酸三铵以及蛋白胨和硫酸铵作为氮源，其中，酵母粉添加量为2.8％、3.8％、4.8％、5.8％、6.8％，以Na
+
、Ca
2+
、Cu
2+
、Fe
2+
、Mg
2+
为金属离子，金属离子添加量为0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％，含水量为培养基总质量的50％
‑
70％。
[0021]固态发酵培养条件如下：培养温度为22℃
‑
34℃，培养pH为4.0
‑
8.0，接种方式菌球和孢子，接种量2％
‑
10％，装料量20g
‑
70g，发酵时长5d。
[0022]将发酵后得到的α
‑
半乳糖苷酶粗酶液进行纯化，并于棉子糖溶液进行水解，分析其水解能力。
[0023]本专利技术有益的技术效果在于：
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株高产α
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半乳糖苷酶的黑曲霉诱变菌株，其特征在于，该菌株分类学命名为Aspergillus sp.D
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23，保藏号为CGMCC No.40330。2.一株高产α
‑
半乳糖苷酶的黑曲霉诱变菌株的选育方法，其特征在于，所述方法步骤如下：(1)将黑曲霉菌株活化培养在PDA固体培养基上，培养3天，用无菌生理盐水将黑曲霉孢子洗脱下来，置于已灭菌的含有玻璃珠的离心管中，充分震荡，将孢子打散，取无菌纱布过滤孢子悬液，利用血球计数板，计算孢子个数，并取生理盐水进行稀释，使孢子浓度为1
×
106个/mL；(2)将步骤(1)得到的孢子悬液在15W紫外灯下垂直照射30cm处，在搅拌状态下，照射1
‑
10min，各取1mL于装有无菌生理盐水的试管中，进行梯度稀释，涂布于初筛培养基上，避光培养48h；(3)将步骤(2)中初筛培养基上显蓝色的单菌落挑选出，接种到液体PDA培养基中，28℃，培养2d；再接种于固态发酵培养基中，以未诱变的初始菌株为对照，28℃，培养5d，测α
‑
半乳糖苷酶的酶活，选择酶活高的菌株为下一步化学诱变的出发菌株；(4)将步骤(3)中复筛发酵所得酶活最高的紫外诱变菌株制成孢子悬液，取硫酸二乙酯和95％乙醇制成DES溶液，将DES溶液与孢子悬液按体积比混合，在28℃振荡处理20
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210min，加入硫代硫酸钠溶液2mL终止反应；各取1mL于装有无菌生理盐水的试管中，进行梯度稀释，涂布于初筛培养基上，避光培养48h；(5)对化学诱变后的菌株进行复筛，复筛同步骤(3)；(6)对诱变复筛得到的黑曲霉诱变菌株进行固态发酵。3.根据权利要求2所述的高产α
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半乳糖苷酶的黑曲霉诱变菌株的选育方法，其特征在于，步骤(1)所述PDA固体培养基成分为：土豆20％，葡萄糖2％，琼脂2％，加水定容至100mL，115℃灭菌30min。4.根据权利要求2所述的高产α
‑
半乳糖苷酶的黑曲霉诱变菌株的选育方法，其特征在于，步骤(2)所述初筛筛选培养基成分为：葡萄糖2％，KNO
3 0.3％，K2HPO
4 0.1％，MgSO4·
7H2O 0.05％，KCl 0.05％，FeSO4·
7H2O 0.001％，琼脂2％，加水定容至100mL，pH 6.5，X
‑
α
‑
Gal 100μL，115℃灭菌30mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡志强，陈可，庞若彤，敖大，岳纹龙，杨广花，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：