一种体外培养梭子蟹肌孢虫的方法技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，涉及疫苗抗原的培养，具体涉及一种体外培养梭子蟹肌孢虫的方法。将RK

【技术实现步骤摘要】
一种体外培养梭子蟹肌孢虫的方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及疫苗抗原的培养，具体涉及一种体外培养梭子蟹肌孢虫的方法。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]梭子蟹肌孢虫(Ameson portunus n.sp.)是微孢子虫Ameson属的一个新种，也是三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的一种新兴病原体，流行病学调查结果表明野生三疣梭子蟹表现出较高感染率，部分流行地区感染率高达90％以上，严重威胁梭子蟹的生长。梭子蟹肌孢虫的感染特点为早期感染症状不明显，往往在养殖后期才会出现感染症状，此时病蟹一般具有极高的虫载量，由于微孢子虫的胞内寄生特点及具有坚固的几丁质外壳，到目前为止没有有效的防治措施。在气温降低后发病蟹出现大面积死亡甚至塘口绝收，未发病蟹由于肌孢虫感染造成病肌肉白化，俗称“牙膏蟹”而丧失商品价值最终导致巨大的经济损失，严重威胁着梭子蟹养殖产业的健康发展。
[0004]虽然已经从海洋甲壳动物的各器官来源获得的原代培养细胞报道越来越多，但到目前为止，还没有任何成功建立海洋甲壳类动物细胞系的报道。在虾蟹养殖产业微孢子虫感染越来越严重的情况下，没有合适的细胞系用于微孢子虫的体外培养是制约甲壳动物微孢子虫病研究的一个重要原因，这也制约着梭子蟹肌孢虫疫苗的研发。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种体外培养梭子蟹肌孢虫的方法，本专利技术的方法能够对梭子蟹肌孢虫进行体外培养，且能够进行大量繁殖并稳定传代，能够为梭子蟹肌孢虫的感染及致病机制并为防治策略的开发提供有用的研究模型。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0007]一方面，一种RK
‑
13细胞在体外培养梭子蟹肌孢虫中的应用。
[0008]本专利技术使用哺乳动物细胞系(人包皮成纤维细胞(HFF)、兔肾细胞(RK
‑
13))、鱼类细胞系(草鱼性腺细胞(GCO)、斑马鱼细胞(ZF4))及昆虫细胞系(昆虫卵巢细胞(SF
‑
9))在各细胞最适生长温度下使用纯化的梭子蟹肌孢虫孢子进行感染，发现感染与增殖只发生于RK
‑
13细胞中，并可稳定传代。
[0009]另一方面，一种体外培养梭子蟹肌孢虫的方法，将RK
‑
13细胞培养至单层细胞，向所述单层细胞中添加梭子蟹肌孢虫孢子，进行梭子蟹肌孢虫的体外培养；梭子蟹肌孢虫的体外培养过程中，每隔设定时间进行一次换液，每次弃去部分旧培养基，并补充等量的新鲜培养基。
[0010]本专利技术的方法可对RK
‑
13细胞造成极高的感染率，细胞内的孢子可大量成熟。
[0011]在虾蟹等甲壳类动物及鱼类微孢子虫病日益严重的背景下，本专利技术方法为多种水生微孢子虫的体外培养提供了思路。因而第三方面，一种上述方法在体外培养除梭子蟹肌孢虫外的水生微孢子虫的应用。
[0012]通过上述涉及方案，本专利技术具有以下优势：
[0013]本专利技术提供的体外培养梭子蟹肌孢虫的方法，使梭子蟹肌孢虫在寄主之外的环境中得以培养，不受季节限制并可随时获取大量具有高活性的梭子蟹肌孢虫孢子。本专利技术以细胞为培养载体，可以在适宜的条件下对梭子蟹肌孢虫进行长期且稳定的培养和保存。
[0014]本专利技术在完全缺乏甲壳类动物细胞系的情况下对梭子蟹肌孢虫进行体外培养，为三疣梭子蟹微孢子虫病提供了良好的研究模型。
附图说明
[0015]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0016]图1为本专利技术实施例在RK
‑
13细胞感染梭子蟹肌孢虫1～15天内成熟孢子数量的折线图及总孢子数量(处于孢子成熟期及成熟孢子的总数)的柱状图；每次统计24孔板中3个孔，感染量1
×
108孢子/孔。
[0017]图2为本专利技术实施例中从被感染RK
‑
13细胞中纯化梭子蟹肌孢虫孢子并对RK
‑
13细胞感染1～15天内成熟孢子数量的折线图及总孢子数量(处于孢子成熟期及成熟孢子的总数)的柱状图；每次统计24孔板中3个孔，感染量7
×
105孢子/孔。
[0018]图3为本专利技术实施例在RK
‑
13细胞感染梭子蟹肌孢虫第8天和第11天的感染拍摄图片，左列为使用直接黄96对细胞内成熟孢子染色图片(感染第8天的标尺为10μm(上)，感染第11天的标尺为5μm(下))，中列为采用DAPI对细胞核染色的图片(感染第8天的标尺为10μm(上)，感染第11天的标尺为5μm(下))，右列为明场拍摄图片(感染第8天的标尺为10μm(上)，感染第11天的标尺为5μm(下))。
[0019]图4为本专利技术实施例中传代至第8代梭子蟹肌孢虫在RK
‑
13细胞内增殖明场照片。
具体实施方式
[0020]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0021]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0022]由于目前的方法难以对梭子蟹肌孢虫进行体外培养，为了解决如上的技术问题，本专利技术提出了一种体外培养梭子蟹肌孢虫的方法。
[0023]本专利技术的一种典型实施方式，提供了一种RK
‑
13细胞在体外培养梭子蟹肌孢虫中的应用。
[0024]在一些实施例中，RK
‑
13细胞作为感染细胞对梭子蟹肌孢虫进行体外培养。
[0025]本专利技术的另一种实施方式，提供了一种体外培养梭子蟹肌孢虫的方法，将RK
‑
13细胞培养至单层细胞，向所述单层细胞中添加梭子蟹肌孢虫孢子，进行梭子蟹肌孢虫的体外培养；梭子蟹肌孢虫的体外培养过程中，每隔设定时间进行一次换液，每次弃去部分旧培养基，并补充等量的新鲜培养基。
[0026]在一些实施例中，将RK
‑
13细胞培养至单层细胞的培养基为含有胎牛血清和双抗的DMEM培养基。较为具体的，胎牛血清的含量为9～11％，双抗的含量为0.9～1.1％。
[0027]在一些实施例中，梭子蟹肌孢虫的体外培养过程在36～38℃、4～6％的CO2培养箱中进行。
[0028]在一些实施例中，换本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RK
‑
13细胞在体外培养梭子蟹肌孢虫中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征是，RK
‑
13细胞作为感染细胞对梭子蟹肌孢虫进行体外培养。3.一种体外培养梭子蟹肌孢虫的方法，其特征是，将RK
‑
13细胞培养至单层细胞，向所述单层细胞中添加梭子蟹肌孢虫孢子，进行梭子蟹肌孢虫的体外培养；梭子蟹肌孢虫的体外培养过程中，每隔设定时间进行一次换液，每次弃去部分旧培养基，并补充等量的新鲜培养基。4.如权利要求3所述的体外培养梭子蟹肌孢虫的方法，其特征是，将RK
‑
13细胞培养至单层细胞的培养基为含有胎牛血清和双抗的DMEM培养基；优选地，胎牛血清的含量为9～11％，双抗的含量为0.9～1.1％。5.如权利要求3所述的体外培养梭子蟹肌孢虫的方法，其特征是，梭子蟹肌孢虫的体外培养过程在36～38℃、4～6％的CO2培养箱中进行。6.如权利要求3所述的体外培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩冰，屈虹男，付明，王永亮，关靖宇，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：