合成的单域文库制造技术

本发明专利技术涉及完全人源化单域抗体骨架的鉴定及其在产生合成单域抗体中的用途。本发明专利技术还涉及包含所述单域抗体骨架的抗原结合蛋白及其在治疗中的用途。其在治疗中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】合成的单域文库


[0001]本专利技术涉及高度稳定的合成单域抗体骨架的鉴定及其在产生合成单域抗体文库中的用途。本专利技术还涉及包含所述稳定的单域抗体骨架的抗原结合蛋白及其用途，特别是作为治疗剂，尤其是用于治疗癌症的用途。

技术介绍

[0002]在过去的十年中，抗体已成为最有希望的治疗方法之一，特别是在肿瘤学领域，以及研究或诊断工具的重要来源。
[0003]免疫球蛋白G(IgG)是典型抗体的基本结构，其包含通过二硫键结合在一起的重链和轻链的两个异二聚体。然而，在至少两组动物中发现了天然单链抗体：骆驼科(Hamers
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Casterman et al,1993,Nature,363,pp446
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448)和鲨鱼(Greenberg et al,Nature.1995,Mar 9；374(6518):168
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73)。这些单链抗体构成无轻链的另一类IgG。这些单链天然抗体的识别部分仅包括称为VHH的重链可变区。VHH含有形成IgG结构域骨架的四个框架(FR)和参与抗原结合的三个互补决定区(CDR)。
[0004]已报道了VHH骨架的许多优点：没有链间二硫键，它们通常在还原环境中更可溶和稳定(Wesolowski et al,2009Med Microbiol Immunol.Aug；198(3):157
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74)。还报道了VHH由于其小尺寸(15kDa)而具有更高的溶解度、表达率和热稳定性(Jobling SA et al,Nat Biotechnol.2003Jan；21(1):77
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80)。此外，VHH框架显示出与人VH结构域的家族III的序列和结构的高度同源性(Muyldermans et al,2001.J Biotechnol.Jun；74(4):277
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302)，以及VHH具有与人VH相当的免疫原性，因此构成用于治疗应用的非常令人感兴趣的制剂。
[0005]VHH骨架的特性具有许多优点，用于治疗：它们在组织中具有更好的穿透性，在肾中清除更快，具有高特异性，但免疫原性降低。
[0006]例如在US 2006/0246058(加拿大国家研究委员会)中描述了骆驼科抗体文库。所述噬菌体展示文库包含美洲驼抗体的片段，尤其是可变重链(VHH和VH)的单域片段。使用未免疫动物的淋巴细胞基因组(原初文库)制备文库。所得噬菌体展示文库还含有常规VH抗体片段的污染物。
[0007]美国专利US 7,371,849(Institute For Antibodies Co.,Ltd)也报道了从骆驼科动物的VHH基因制备VHH文库的方法。这种文库的多样性是通过改进从天然库分离VHH可变区的常规方法获得的。然而，这些现有技术没有解决来自非人来源的抗体的免疫原性问题。即使它们中的一些被鉴定为结合特定的目标靶标，它们也不能作为治疗剂在没有激活人免疫系统的风险的情况下在患者中施用。
[0008]人源化骆驼单域抗体的方法描述于Vincke et al,2008,JBC Vol 284(5)pp 3273
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3284中。
[0009]美国专利US 8,367,586公开了合成抗体或其片段的集合。这些抗体包含可变重链和可变轻链对，且在其框架区中具有最佳种系基因序列中的一部分。这种人序列的引入使
得降低免疫原性风险用于治疗用途。
[0010]Monegal等(2012,Dev Comp Immunol.36(1):150
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6)报道了在美洲驼天然文库的生物淘选过程中重复鉴定了具有VH标记的单域抗体。事实上，与VHH标记相比，VH标记更经常在选自VHH天然文库的结合剂上被识别。例如，Monegal等已表明，5％的VH标记是在天然文库中发现，而20％的VH标记是在针对抗原的生物筛选后选择的抗体中发现的。
[0011]最近，Moutel等(eLife 2016；5:e16228)和WO 2015063331公开了提供功能性高亲和力抗体和胞内抗体的人源化纳米抗体的合成文库。
[0012]然而，尽管有这些知识，仍然需要提供具有改进的人源化的另外的单域抗体文库，同时保留单域特异性和优点，特别是它们的高溶解度和表达率。
[0013]因此，本专利技术的一个方面是提供高度多样性的完全人源化的重组单域抗体文库，其能够产生高度稳定的针对特定抗原具有高亲和力的单域抗体。另一方面是提供富含在细胞内环境中有活性的单域抗体的文库。另一方面是提供富含具有高热稳定性的单域抗体的文库。通常，根据本公开获得的单域抗体也具有高表达率。通常地，所述单域抗体还可以克服单抗的经典技术问题，诸如缓慢的血液清除、实体瘤的限制性穿透、健康组织的非特异性吸收和无法接近隐性表位。
[0014]专利技术简述
[0015]在与人不同的10个氨基酸上，已在VHH的框架
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2区中鉴定了VHH的4个标记(hallmark)氨基酸。专利技术人惊奇地发现，这4个骆驼科标记可以被4个典型的人类标记代替，同时保留VHH特性。本文提供的结果显示本文公开的合成单域抗体文库可以获得合成人源化sdAb，其对它们的靶标具有在纳摩尔/皮摩尔范围内的高度特异性的亲和力。已获得针对各种细胞靶标的sdAb，其可用作活细胞的胞内标记的胞内抗体。所述sdAb可用于染色靶细胞。此外，它们能够抑制其靶标的下游活化(即FGFR4途径)。所述sdAb还可用于将有效负载递送至靶细胞、臂T细胞和使用CAR
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T细胞方法破坏靶向细胞。因此，这些结果表明本专利技术的合成单域抗体文库提供了与细胞标记、诊断和治疗应用高度相关的单域抗体。
[0016]本专利技术的目的通过制备合成单域抗体文库的方法实现，所述方法包括以下步骤：
[0017]i)在人源化合成单域抗体(下文可称为“hs2dAb”)的相应框架编码区之间引入编码CDR1、CDR2和CDR3的多种核酸，以产生编码合成单域抗体的多种核酸，所述合成单域抗体具有相同合成单域骨架的氨基酸序列；
[0018]其中所述合成单域抗体骨架的氨基酸序列至少含有以下氨基酸残基：FRW2
‑
V4、FRW2
‑
G11、FRW2
‑
L12、FRW2
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W14。
[0019]在一些实施方案中，单域抗体骨架源自美洲驼物种。
[0020]在一些实施方案中，本文公开的合成单域抗体(hs2dAb)还包含至少一个选自下组的氨基酸残基：
[0021]‑
FRW1
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V5、FRW1
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E6、FRW1
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L11、FRW3
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V35、FRW4
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R2、和FRW4
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L7；和/或
[0022]‑
FRW1
‑
P14、FRW3
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S17、FRW本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.制备合成单域抗体文库的方法，所述方法包括：i.在合成单域抗体的相应框架编码区之间引入编码CDR1、CDR2和CDR3的多种核酸，以产生编码多种合成单域抗体的核酸，所述合成单域抗体具有相同的合成单域抗体骨架氨基酸序列，其中所述合成单域抗体骨架包含下列氨基酸残基：FRW2
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V4、FRW2
‑
G11、FRW2
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L12、FRW2
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W14、FRW1
‑
V5、FRW1
‑
E6、FRW1
‑
L11、FRW3
‑
V35、FRW4
‑
R2、FRW4
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L7。2.根据权利要求3所述的方法，其中所述合成单域抗体骨架还包含至少一个以下的氨基酸残基：FRW1
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P14、FRW3
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S17、FRW3
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R29、FRW3
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A30、FRW2
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S16、FRW3
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K18、FRW3
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V21、FRW3
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Y22、FRW3
‑
L23、FRW3
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S27。3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述合成单域抗体骨架包含由以下组成的框架区：SEQ ID NO:1的FRW1、SEQ ID NO:2的FRW2、SEQ ID NO:3的FRW3和SEQ ID NO:4的FRW4，或在每个框架区内具有不超过1、2或3个保守氨基酸取代的功能性变体框架区，条件是所述合成单域抗体骨架含有至少一个下组的氨基酸残基：FRW2
‑
V5、FRW3
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V21和FRW4
‑
R2。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述合成CDR1和CDR2的氨基酸残基通过以下规则确定：
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在CDR1第1位：Y、R、S、T、F、G、A，或D；
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在CDR1第2位：Y、S、F、G或T；
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在CDR1第3位：Y、S、F，或W；
‑
在CDR1第4位：Y、R、S、T、F、G、A、W、D、E、K或N；
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在CDR1第5位：S、T、F、G、A、W、D、E、N、I、H、R、Q，或L；
‑
在CDR1第6位：S、T、Y、D，或E；
‑
在CDR1第7位：S、T、G、A、D、E、N、I，或V；
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在CDR2第1位：R、S、F、G、A、W、D、E，或Y；
‑
在CDR2第2位：S、T、F、G、A、W、D、E、N、H、R、Q、L或Y；
‑
在CDR2第3位：S、T、F、G、A、W、D、E、N、H、Q、P；
‑
在CDR2第4位：G、S、T、N、或D；
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在CDR2第5位：S、T、F、G、A、Y、D、E、N、I、H、R、Q、L、P、V、W、K或M；
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在CDR2第6位：S、T、F、G、A、Y、D、E、N、I、H、R、Q、L、P、V、W，或K；
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在CDR2第7位：S、T、F、G、A、Y、D、E、N、I、H、R、Q、L、P，或V；且其中CDR3氨基酸序列包含9至18个氨基酸，任选地选自以下氨基酸中的一个或多个：S、T、F、G、A、Y、D、E、N、I、H、R、Q、L、P、V、W、K、M。5.可通过权利要求1
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4中任一项所述的方法获得的合成单域抗体文库。6.权利要求5所述的合成单域抗体文库，其包含至少1.109种不同的抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：F，
申请(专利权)人：国家科学研究中心，
类型：发明
国别省市：