一种基于PCR-免疫金标试纸条鉴别虹鳟鱼真伪的引物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于PCR

【技术实现步骤摘要】
一种基于PCR
‑
免疫金标试纸条鉴别虹鳟鱼真伪的引物、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及水产品鉴定
，具体涉及一种基于PCR
‑
免疫金标试纸条鉴别虹鳟鱼真伪的引物、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]鲑科鱼类是北半球洄游性中型的冷水性鱼类，是世界三大养殖鱼类之一，并且其海水养殖产量占世界海水鱼类养殖产量的一半以上。主要分为3个亚科，11 个属，约70种。包括茴鱼亚科、白鲑亚科、鲑亚科。虹鳟鱼属于鲑科、太平洋鲑属其头部无鳞，眼鳍基上缘有长腋鳞。侧线侧中位，前端较高；成年虹鳟体重可达约2.8kg，头大吻端尖者为雄鱼，吻钝而圆者为雌鱼；是重要的淡水以及半咸水鲑科养殖鱼类之一，是目前世界上养殖最为广泛的冷水性经济鱼类。
[0003]2000～2009年十年间，世界上共养殖生产鲑科鱼类1989万吨，产量一直在稳步上升，由2000年的153.8万吨，逐步增加到2009年的241.8万吨，全球共有69个国家和地区养殖鲑科鱼类，欧洲占47.8％、美洲占18.8％、亚洲占17.4％、非洲占10.1％、大洋洲占5.9％，95.7％养殖鲑科鱼类的国家养殖虹鳟鱼。
[0004]随着国际水产贸易的兴起，部分国内外企业，受高额利润驱使，以假充真、以劣充好的事件时有发生。
[0005]鱼类市场上的乱象在鲑科鱼市场上也是存在的，所以建立完善鲑科鱼质量评价体系是十分必要的，不仅能促进产业的健康稳定的发展，也能进一步提高消费者对于鲑科鱼的认可度。所以鲑科鱼质量安全鉴定和质量评价标准研究。
[0006]目前国内鲑科鱼消费形式是多种多样的，既有以传统饮食方式的烹调，又有以现代方式的鲜食，且随着经济水平和人们物质文化需求的提高，鲑科鱼这一健康食品会得到越来越多人的青睐。我国鲑科鱼养殖已初见规模，随着养殖技术提高、养殖品种不断改良和产业链条的日趋完善，鲑科鱼市场发展前景广阔。
[0007]分子鉴定技术逐渐成为物种真伪鉴定的主要手段，与传统鉴定方法相比，虹鳟鱼分子鉴定技术有其独特的优势。而目前，虹鳟鱼的分子鉴定方法的开发主要是形态学鉴定和普通PCR方法，但由于形态学鉴定的局限性以及普通 PCR需要PCR仪和电泳仪等设备进行实验，耗时较长，并且易出现假阳性的现象。荧光PCR将PCR扩增反应与结果检测相结合，实现了全程在封闭的状态下进行扩增和产物的分析，减少了PCR后续处理，降低了PCR扩增产物污染的概率，提高了特异性，还避免了电泳时染料对人体的危害。
[0008]目前用于鱼类物种扩增的基因区段多为线粒体DNA。相比于核DNA，线粒体DNA不经过重组等基因重排过程，并具有更高的拷贝数和更低的突变率，所以更适合进行种内和种间的遗传研究，适合用于虹鳟鱼的鉴别。
[0009]随着水产品掺假形式的多样化，在虹鳟鱼真伪鉴别方面，现有的基于PCR 的分子鉴定方法和DNA条形码技术均有不足，实现快速准确的鉴定体系还有待进一步的研究，虹鳟
鱼真伪鉴别检测技术还需要更多的研究和实践探索，才能达到更理想的结果。

技术实现思路

[0010]本专利技术将PCR
‑
免疫金标试纸条检测技术应用在虹鳟鱼的真伪鉴别中，并找到特异性强的引物来实现简单、快速、准确鉴定虹鳟鱼及其掺伪品的方法，弥补了现有虹鳟鱼真伪鉴别技术的不足。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0012]根据本专利技术的第一方面，提供了一种基于PCR
‑
免疫金标试纸条鉴别虹鳟鱼真伪的引物，所述引物序列如下：
[0013]F：5
’‑
FAM
‑
GTCCCACTGTGGCTTGCT
‑3’
；
[0014]R：5
’‑
Biotin
‑
GGGTTCCTTCAGGCAATAA
‑3’
。
[0015]根据本专利技术的第二方面，提供了一种基于PCR
‑
免疫金标试纸条鉴别虹鳟鱼真伪的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的基于PCR
‑
免疫金标试纸条鉴别虹鳟鱼真伪的引物。
[0016]进一步地，还包括免疫金标试纸条，所述免疫金标试纸条的检测线上包被有FITC单克隆抗体，所述FITC单克隆抗体标记目的基因特异性PCR上下游引物，所述引物为如上所述的基于PCR
‑
免疫金标试纸条鉴别虹鳟鱼真伪的引物。
[0017]根据本专利技术的第三方面，提供了一种基于PCR
‑
免疫金标试纸条鉴别虹鳟鱼真伪的检测方法，包括如下步骤：
[0018](1)提取样本DNA；
[0019](2)以步骤(1)中提取的样本DNA为模板，应用如上所述的试剂盒，进行PCR扩增；
[0020](3)结果分析：将扩增产物点样在免疫金标试纸条上，进行显色反应。
[0021]进一步地，所述步骤(2)中PCR扩增体系为：
[0022][0023][0024]进一步地，所述步骤(2)中PCR扩增程序为：
[0025]95℃预变性5min；95℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸5min。
[0026]进一步地，所述步骤(3)中结果分析方法为：
[0027]当质检带和检测带均出现肉眼可见的胶体金条带时，判定为检测阳性；
[0028]当质检带出现肉眼可见的胶体金条带，但检测线无条带时，判定为阴性；
[0029]当质检带无条带而检测带有条带时，判定为无效结果。
[0030]进一步地，所述步骤(2)中PCR扩增体系中，DNA模板引物浓度为10ng/ μL
‑
100ng/μL。
[0031]本专利技术具有如下优点：
[0032]本申请将PCR扩增和免疫金标试纸条相结合，通过点样后检测带快速显色来判定虹鳟鱼的真伪，具有高效快速和准确的特点；本申请通过设计特异性强的引物和标记抗体，能够在低浓度DNA模板条件下成功扩增出目标序列，相对于现有技术，灵敏度大大提高。
附图说明
[0033]为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0034]本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本专利技术可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本专利技术所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本专利技术所揭示的
技术实现思路
得能涵盖的范围内。
[0035]图1PCR
‑
免疫金标试纸条特异性实验结果图；
[0036]其中，1号为空白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于PCR
‑
免疫金标试纸条鉴别虹鳟鱼真伪的引物，其特征在于，所述引物序列如下：F：5
’‑
FAM
‑
GTCCCACTGTGGCTTGCT
‑3’
；R：5
’‑
Biotin
‑
GGGTTCCTTCAGGCAATAA
‑3’
。2.一种基于PCR
‑
免疫金标试纸条鉴别虹鳟鱼真伪的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的基于PCR
‑
免疫金标试纸条鉴别虹鳟鱼真伪的引物。3.如权利要求2所述的基于PCR
‑
免疫金标试纸条鉴别虹鳟鱼真伪的试剂盒，其特征在于，还包括免疫金标试纸条，所述免疫金标试纸条的检测线上包被有FITC单克隆抗体，所述FITC单克隆抗体标记目的基因特异性PCR上下游引物，所述引物为如权利要求1所述的基于PCR
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免疫金标试纸条鉴别虹鳟鱼真伪的引物。4.一种基于PCR
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【专利技术属性】
技术研发人员：郑文杰，季超，李长忠，金文杰，陈艳霞，
申请(专利权)人：青海大学，
类型：发明
国别省市：