试剂盒及小布氏鲸物种鉴定方法技术

本发明专利技术公开一种小布氏鲸物种鉴定方法及试剂盒，其中，小布氏鲸物种鉴定方法包括如下步骤：采用33组引物对所述总环境DNA进行多重PCR扩增；针对上述多重PCR扩增产物进行高通量测序；去掉测序产生的接头序列、无引物非特异性扩增序列；去掉未比对上参考数据库的序列；将剩余序列进行组装，得到相对于单个序列更长的contig序列；将得到的contig序列与小布氏鲸及小布氏鲸的近源物种的DNA序列进行比对。本发明专利技术提出了一种全新的环境DNA样品检测技术，该技术采用eDNA、多重PCR和高通量测序等三种技术相结合的模式，综合了现有eDNA技术两种主流策略的优点，规避了两者的缺点，实现特定海域中小布氏鲸的物种鉴定，具有技术成本低、灵敏度高、精确度高的优点。精确度高的优点。精确度高的优点。

【技术实现步骤摘要】
试剂盒及小布氏鲸物种鉴定方法


[0001]本专利技术涉及生物鉴定
，特别涉及一种试剂盒及小布氏鲸物种鉴定方法。

技术介绍

[0002]生物的物种鉴定是研究一切生物的前提，也是生物多样性监测和保护的最基本、最核心的工作。最早的物种鉴定手段通常使用生物的生活习性、表型、声音等特征数据，但这些数据往往不易定量且不够稳定，很容易造成鉴定错误，只能作为辅助鉴定手段。随着分子生物学技术的发展，基于物种某个基因片段的物种鉴定方法——DNA条形码技术已成为目前最常用的物种鉴定手段，但该方法需要直接采集生物个体的组织样本以提取DNA，这必定会对生物体造成伤害。近年来，随着eDNA(环境DNA)技术的问世，我们可以通过采集水样的方式直接预测该片水域中的生物种类和丰度，减少了对目标研究物种的伤害，还极大的提高了检测效率。该方法往往采用传统PCR手段且只设计一对引物去捕获目标片段，所以随机性高且灵敏度低；另一种策略是直接对水体总DNA进行建库、高通量测序和数据分析，该技术极度依赖于比对分析所用的数据库，且测序深度往往不足以覆盖所有DNA片段，从而丢失丰度较低的序列和物种信息，从而造成假阴性。

技术实现思路

[0003]本专利技术的主要目的是提供一种小布氏鲸物种鉴定方法，旨在解决现有技术鉴定灵敏度低及准确率差的问题。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提出的一种小布氏鲸物种鉴定方法，包括如下步骤：
[0005]a、提取海水样本中的总环境DNA；
[0006]b、采用表2所示的33组引物对所述总环境DNA进行多重PCR扩增；
[0007]c、针对上述多重PCR扩增产物进行高通量测序；
[0008]d、去掉测序产生的接头序列、无引物非特异性扩增序列；
[0009]e、去掉未比对上参考数据库的序列；
[0010]f、将剩余序列进行组装，得到相对于单个序列更长的contig序列；
[0011]g、将得到的contig序列与小布氏鲸及小布氏鲸的近源物种的DNA序列进行比对。
[0012]在一实施例中，所述步骤a包括：
[0013]采用2～5℃条件下离心20～40分钟的方法过滤掉水样中的大颗粒杂质，并取上清液；
[0014]使用已灭菌的水样真空抽滤装置，对离心后的上清液进行过滤，水样依次通过孔径142mm、90mm的滤纸过滤掉水样中的颗粒较小的杂质；
[0015]通过真空抽滤方法将DNA富集在孔径为0.45μm的微孔滤膜上；
[0016]取出微孔滤膜，加入液氮碾碎，将碎屑收集于离心管中，然后采用eDNA 提取试剂盒提取富集在滤膜碎屑上的水体总DNA。
[0017]在一实施例中，所述步骤b中PCR扩增条件如下：
[0018]PCR循环为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，65℃退火50秒(每次循环后降低1℃)，循环10次；95℃变性30秒，58℃退火30秒，循环25 次；72℃延伸15秒；72℃再延伸60秒，最后12℃保温。
[0019]在一实施例中，在所述步骤b与所述步骤c之间还包括：将扩增产物在 1.5％琼脂糖凝胶中电泳鉴定，观察是否在200
‑
300bp之间得到明显的目的条带。
[0020]在一实施例中，所述步骤a包括：
[0021]以小布氏鲸线粒体全基因组序列为模板，生成各位点的候选引物；
[0022]设置引物筛选参数如下：扩增目标片段长度200
‑
300bp；引物长度17
‑
34 bp；解链温度65℃以上。
[0023]在一实施例中，所述步骤a与所述步骤b之间还包括：
[0024]对所述候选引物进行过滤，去除末端5bp碱基序列一致的候选引物；
[0025]根据DNA序列特征，仅保留引物序列区相对保守、且所扩增目标序列属于高变区的候选引物，得到如表2所述的33对引物。
[0026]本专利技术还提供一种试剂盒，其特征在于，包括如表2所述的33对引物序列。
[0027]本专利技术采用eDNA、多重PCR、高通量测序三种技术相结合的方法，能很好的弥补常规eDNA技术两种策略的不足。首先，在高通量测序前增加多重PCR，能过滤干扰信号，大大降低测序深度的要求，将每个样的测序数据量从几十甚至上百Gb降低到数百Mb，节约测序和分析成本十倍以上。其次，多重PCR放大了目标信号，大大提高了检测的灵敏度。最后，在保证一次PCR 操作的情况下，通过增加引物数量，将有效基因片段一次性增加数十倍，大大提高了检测的精确度。综上，本专利技术综合了现有eDNA技术两种主流策略的优点，规避了两者的缺点，在检测的成本、灵敏度和精确度上均有明显优势。
附图说明
[0028]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
[0029]图1为在深圳大鹏湾沙鱼涌海域的8个采样点共采集11份水样；其中，黑圈白字所示1
‑
3号采样点采样日期为2021年7月5日，白圈黑字所示1
‑
5号采样点采样日期为2021年7月10日；S1
‑
S11为样本编号；
[0030]图2为33对引物扩增目标片段对应到参考序列的位置；黑色线条表示线粒体全基因组序列示意图；
[0031]图3a为高通量测序后得到的多个DNA片段序列示意图；
[0032]图3b为在图3a的基础上，过滤掉测序产生的接头序列、无引物的非特异性扩增序列后的DNA片段序列示意图；
[0033]图3c为在图3b的基础上去掉未比对上参考数据库的数据剩余的DNA序列示意图；
[0034]图3d为在图3c的基础上去掉无法拼接和拼接较短的序列后剩余的DNA 序列示意图；
[0035]图3e为在图3d的基础上组装成多条更长的Contig序列示意图；
[0036]图3f为在图3e的基础上，将多序列与近缘物种多序列比的对示意图；
[0037]图4为组装的contigs对应参考序列、目标片段的位置；Primers所示为引物所扩增出的目标片段区域，Contigs所示为最终组装到的13条contigs序列；
[0038]图5为基于33对引物扩增出的线粒体全基因组数据构建的最大似然树。
[0039]本专利技术目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
[0040]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0041]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小布氏鲸物种鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：a、提取海水样本中的总环境DNA；b、采用表2所示的33组引物对所述总环境DNA进行多重PCR扩增；c、针对上述多重PCR扩增产物进行高通量测序；d、去掉测序产生的接头序列、无引物非特异性扩增序列；e、去掉未比对上参考数据库的序列；f、将剩余序列进行组装，得到相对于单个序列更长的contig序列；g、将得到的contig序列与小布氏鲸及小布氏鲸的近源物种的DNA序列进行比对。2.如权利要求1所述的小布氏鲸物种鉴定方法，其特征在于，所述步骤a包括：采用2～5℃条件下离心20～40分钟的方法过滤掉水样中的大颗粒杂质，并取上清液；使用已灭菌的水样真空抽滤装置，对离心后的上清液进行过滤，水样依次通过孔径142mm、90mm的滤纸过滤掉水样中的颗粒较小的杂质；通过真空抽滤方法将DNA富集在孔径为0.45μm的微孔滤膜上；取出微孔滤膜，加入液氮碾碎，将碎屑收集于离心管中，然后采用eDNA提取试剂盒提取富集在滤膜碎屑上的水体总DNA。3.如权利要求2所述的小布氏鲸物种鉴定方法，其特征在于，所述步骤b中PCR扩增条件如下：PCR循环为：95℃预变性5分钟；...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄玉，游欣欣，阮志强，逯峰，徐赟，石琼，徐军民，
申请(专利权)人：深圳市华大海洋研究院，
类型：发明
国别省市：