水产养殖中抗生素抗性基因的定量检测及风险评估方法技术

本发明专利技术公开了一种水产养殖中抗生素抗性基因的定量检测及风险评估方法，该方法包括如下步骤：S1.样品水样的采集与总DNA提取；S2.制备目标DNA标准品，并建立实时荧光定量PCR的标准曲线；S3.根据实时荧光定量PCR的标准曲线得到养殖环境水体和养殖生物中的ARGs绝对丰度，并将不同种ARGs的绝对丰度构建ARGs样本数据集；S4.对ARGs样本数据集进行数据误差缩小处理得到ARGs数据误差缩小处理值；S5.对ARGs数据误差缩小处理值进行风险赋值，得到ARGs风险评分，再根据单个ARGs风险评分，计算ARGs总风险评分。本发明专利技术在水产养殖环境检测中适用范围广，PCR扩增效率高，测量准确度高。测量准确度高。测量准确度高。

【技术实现步骤摘要】
水产养殖中抗生素抗性基因的定量检测及风险评估方法


[0001]本专利技术涉及环境和基因检测
，具体涉及一种水产养殖中抗生素抗性基因的定量检测及风险评估方法。

技术介绍

[0002]近年来，由于在水产养殖过程中大量抗生素的滥用，导致了抗生素抗性基因(Antibiotics resistance genes，ARGs)在养殖过程中快速传播扩散。抗生素抗性基因作为一类新型环境污染物，目前已经被证实在水产养殖环境中具有巨大的存储量，大量未被利用的抗生素将对养殖区域及其周边环境造成潜在基因污染，抗生素抗性基因还极有可能在环境中传播、扩散，对公共健康和食品、饮用水安全构成威胁。
[0003]但是当前对抗生素抗性基因的相关研究还较少，尚未建立统一的检测方法来测定水产养殖环境中的抗生素抗性基因，且绝大多数的水产养殖环境可提取的样本水样核酸量均较少，无法满足对抗生素抗性基因的准确分析要求。
[0004]因此，为了加强对水产养殖环境的监测和保护，规范水产养殖行业的标准及养殖污水的排放，进而保障水产消费者的生命安全，亟需开发一种水产养殖环境中抗生素抗性基因的定量检测及风险评估的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术专利的目的是提供一种水产养殖中抗生素抗性基因的定量检测及风险评估方法，尤其是四环素类、磺胺类和氯霉素类抗生素的耐药基因的定量检测及风险评估的方法。
[0006]上述的目的通过以下技术方案实现：
[0007]水产养殖中抗生素抗性基因的定量检测及风险评估方法，该方法包括如下步骤：
[0008]S1.样品水样的采集与总DNA提取；
[0009]S2.制备目标DNA标准品，并建立实时荧光定量PCR的标准曲线；
[0010]S3.根据步骤S2建立的实时荧光定量PCR的标准曲线得到养殖环境水体和养殖生物中的ARGs绝对丰度，并将不同种ARGs的绝对丰度构建为具备X个元素的一组样本数据，即ARGs样本数据集；
[0011]S4.对步骤S3中得到的ARGs样本数据集进行数据误差缩小处理得到ARGs数据误差缩小处理值；
[0012]S5.对步骤S4中得到的ARGs数据误差缩小处理值进行风险赋值，得到ARGs风险评分，再根据单个ARGs风险评分，计算ARGs总风险评分。
[0013]进一步地，步骤S1所述样品水样的采集与总DNA提取的具体方法包括如下步骤：
[0014]S1
‑
1.采用高温高压灭菌的采水器采集距离水面50cm处的水体作为样本水样；
[0015]S1
‑
2.待水样沉淀，用装有0.22μm微孔滤膜的真空抽滤装置进行抽滤，取出滤膜装至灭菌离心管中，液氮速冻3
‑
5min，然后转移至
‑
80℃冰箱中保存待测
[0016]S1
‑
3.将滤膜取出后，用高温高压灭菌的剪刀将滤膜剪碎，采用E.Z.N.A.
TM
Water DNA Kit(Omega，美国)DNA提取试剂盒提取和纯化样本总DNA。
[0017]进一步地，步骤S2中所述制备目标DNA标准品，并建立实时荧光定量PCR的标准曲线的具体方法是：
[0018]S2
‑
1.通过PCR反应扩增出耐药基因的DNA片段：
[0019]以抗生素抗性基因阳性菌株所提取的基因组DNA为模板扩增出200bp以下的DNA片段，其中PCR反应体系共20μL，包括：
[0020]2x Rapid Taq Master Mix 10μL；
[0021]浓度为10μM的上游引物0.8μL；
[0022]浓度为10μM的下游引物0.8μL；
[0023]ddH2O 7.4μL；
[0024]模板DNA 1μL；
[0025]反应程序为：预变性：95℃5min；变性：95℃30s，退火：58℃30s，延伸：72℃30s，35个循环；72℃5min；
[0026]所述上游引物和下游引物和荧光定量PCR采用相同引物序列，为：
[0027]tetx：
[0028]上游引物：AAATTTGTTACCGACACGGAAGTT
[0029]下游引物：CATAGCTGAAAAAATCCAGGACAGTT
[0030]sul1：
[0031]上游引物：CGCACCGGAAACATCGCTGCAC
[0032]下游引物：TGAAGTTCCGCCGCAAGGCTCG
[0033]sul3：
[0034]上游引物：TCCGTTCAGCGAATTGGTGCAG
[0035]下游引物：TTCGTTCACGCCTTACACCAGC
[0036]cmlA：
[0037]上游引物：GTTGGCGGTACTCCCTTGCC
[0038]下游引物：GGCCACCTCCCAGTAGAACG
[0039]S2
‑
2.切胶回收耐药基因的PCR产物；
[0040]S2
‑
3.将回收的PCR产物与克隆载体连接成环状质粒，转化至感受态细菌进行克隆；
[0041]S2
‑
4.通过蓝白实验筛选阳性克隆子，分离纯化后提取质粒；
[0042]S2
‑
5.梯度稀释标准质粒制备荧光定量PCR标准曲线。
[0043]进一步地，步骤S4所述对步骤S3中得到的ARGs样本数据集进行数据误差缩小处理得到ARGs数据误差缩小处理值的公式是：
[0044][0045]其中，为ARGs样本数据集中第t种ARGs的数据误差缩小处理值，为ARGs样本数据集中第t种ARGs的水体绝对丰度，为ARGs样本数据集中第t种ARGs的养
殖生物指标之一绝对丰度，为ARGs样本数据集中第t种ARGs的养殖生物指标之二绝对丰度。
[0046]进一步地，步骤S5的具体方法是：
[0047]S5
‑
1：对ARGs数据误差缩小处理值进行风险赋值，得到ARGs风险评分，对ARGs数据误差缩小处理值进行风险赋值的公式为：
[0048][0049]其中，为第t类ARGs数据误差缩小处理值的风险评分，第t类ARGs数据误差缩小处理值的风险系数，为ARGs样本数据集中第t种ARGs的数据误差缩小处理值；
[0050]S5
‑
2：根据单个ARGs风险评分，计算ARGs总风险评分，计算公式为：
[0051][0052]其中，S
ARGs
为ARGs总风险评分，t为ARGs的种类数，为第t类ARGs数据误差缩小处理值的风险评分。
[0053]有益效果：本专利技术具有以下优点：
[0054]本专利技术通过荧光定量PCR技术对水产养殖环境样本中抗生素抗性基因tetX、sul1、sul3和cmlA进行了定量检测及风险评估，在水产养本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水产养殖中抗生素抗性基因的定量检测及风险评估方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1.样品水样的采集与总DNA提取；S2.制备目标DNA标准品，并建立实时荧光定量PCR的标准曲线；S3.根据步骤S2建立的实时荧光定量PCR的标准曲线得到养殖环境水体和养殖生物中的ARGs绝对丰度，并将不同种ARGs的绝对丰度构建为具备X个元素的一组样本数据，即ARGs样本数据集；S4.对步骤S3中得到的ARGs样本数据集进行数据误差缩小处理得到ARGs数据误差缩小处理值；S5.对步骤S4中得到的ARGs数据误差缩小处理值进行风险赋值，得到ARGs风险评分，再根据单个ARGs风险评分，计算ARGs总风险评分。2.根据权利要求1所述的水产养殖中抗生素抗性基因的定量检测及风险评估方法，其特征在于，步骤S1所述样品水样的采集与总DNA提取的具体方法包括如下步骤：S1
‑
1.采用高温高压灭菌的采水器采集距离水面50cm处的水体作为样本水样；S1
‑
2.待水样沉淀，用装有0.22μm微孔滤膜的真空抽滤装置进行抽滤，取出滤膜装至灭菌离心管中，液氮速冻3
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5min，然后转移至
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80℃冰箱中保存待测S1
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3.将滤膜取出后，用高温高压灭菌的剪刀将滤膜剪碎，采用E.Z.N.A.
TM
Water DNA Kit(Omega，美国)DNA提取试剂盒提取和纯化样本总DNA。3.根据权利要求1所述的水产养殖中抗生素抗性基因的定量检测及风险评估方法，其特征在于，步骤S2中所述制备目标DNA标准品，并建立实时荧光定量PCR的标准曲线的具体方法是：S2
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1.通过PCR反应扩增出耐药基因的DNA片段：以抗生素抗性基因阳性菌株所提取的基因组DNA为模板扩增出200bp以下的DNA片段，其中PCR反应体系共20μL，包括：2x Rapid Taq Master Mix 10μL；浓度为10μM的上游引物0.8μL；浓度为10μM的下游引物0.8μL；ddH2O 7.4μL；模板DNA 1μL；反应程序为：预变性：95℃ 5min；变性：95℃ 30s，退火：58℃ 30s，延伸：72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凯，唐鹏，邢秀梅，许伟鹤，张雯雯，暨杰，尹绍武，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：