一种光催化诱导获得细菌小菌落变异体的方法及其应用技术

本发明专利技术属于环境微生物技术领域，公开了一种光催化诱导获得细菌小菌落变异体的方法及其应用。该方法将细菌菌种接种到营养肉汤中复苏培养，使细菌生长至对数生长期；离心后去除上清液得到菌体，用生理盐水洗涤并重悬菌体，调整细菌的光密度，用生理盐水进行梯度稀释，得到初始菌悬液，将初始菌悬液调节pH至5.5～9.2，溶解氧浓度为1～9mg/L，再插入片状TiO2纳米管，使用LED紫外灯进行光催化诱导，得到细菌小菌落变异体。该方法通过调整初始菌悬液浓度、片状TiO2纳米管、紫外灯光强以及诱导时间等不同理化参数，适用不同种类和浓度下的细菌小菌落变异体体的诱导，实现小菌落变异体的稳定诱导，可应用在环境微生物领域。可应用在环境微生物领域。可应用在环境微生物领域。

【技术实现步骤摘要】
一种光催化诱导获得细菌小菌落变异体的方法及其应用


[0001]本专利技术属于环境微生物
，更具体地，涉及一种光催化诱导获得细菌小菌落变异体的方法及其应用。

技术介绍

[0002]2019年，抗微生物药物的耐药性问题入选了2019年度人类健康面临的十大威胁，并且目前耐药性的演变速度已经超过了新型抗生素的研发速度，可见这个问题迫切需要解决。在实际的环境演替中，微生物可以通过进入休眠来获得抗生素耐受性，并发展成抗生素耐药性。细菌在进入休眠状态后，其对外界应激的耐受性大幅度提升，从而能够加速抗生素抗性的获得。因此，进一步了解并控制细菌的休眠及其休眠机制具有重大意义。部分细菌在受到外界应激后，会在琼脂板上长出直径异常小的菌落，这些小菌落被称为细菌小菌落变异体。小菌落变异体的菌落直径通常仅为正常野生型菌落的十分之一左右。小菌落变异体通常与细菌慢性感染和持留性感染相关，其特征通常包括表型不稳定、生长速率低下、毒力减弱、能够在宿主细胞中存活很长时间并且能够逃避免疫系统的杀伤作用。由于其菌落直径过小、无色素和为非溶血性菌落，在琼脂板上的生长初期很难观察到其表型。此外，由于诱导获取手段存在差异，通常经诱导获得的小菌落变异体存在浓度低和稳定性差等缺点。因此，目前亟需要建立一种适用范围宽，可针对不同类型细菌；操作性强，可精准调整各项参数以达到调控不同细菌诱导形成细菌小菌落变异体的通用研究方法；提供一种成本低廉，原材料易得，相对环保的光催化诱导调控方法。

技术实现思路

[0003]为了解决上述细菌小菌落变异体难以获得的问题，本专利技术提供一种光催化诱导获得细菌小菌落变异体的方法。该方法通过调控光催化诱导反应的细菌种类、初始菌悬液浓度、片状TiO2纳米管光催化剂、紫外灯光强以及诱导时间等理化参数对细菌小菌落变异体诱导的影响，实现了对细菌小菌落变异体的诱导获得。
[0004]本专利技术的另一目的在于提供上述光催化诱导获得细菌小菌落变异体的方法的环境微生物应用。
[0005]本专利技术的目的通过下述方案来实现：
[0006]一种光催化诱导获得细菌小菌落变异体的方法，包括以下步骤：
[0007]S1.将细菌菌种接种到营养肉汤中复苏培养，在0～40℃进行恒温培养，使细菌生长至对数生长期；
[0008]S2.将对数生长期的细菌离心后去除上清液得到菌体，用生理盐水洗涤并重悬菌体，最后调整细菌的光密度，用生理盐水进行梯度稀释，得到初始菌悬液；
[0009]S3.将碳酸氢钠溶液或磷酸溶液添加到初始菌悬液中调节pH至5.5～9.2，控制溶解氧浓度为1～9mg/L，放置在恒温箱中控温在0～60℃，即为模拟环境条件；
[0010]S4.向模拟环境条件的初始菌悬液中插入片状TiO2纳米管，使用发射波长为为
365nm的LED紫外灯进行光催化诱导，实现对细菌小菌落变异体的诱导。
[0011]优选地，步骤S1中所述的细菌为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌或金黄色葡萄球菌的一种以上。
[0012]优选的，步骤S1中所述的培养时间为1～20h。
[0013]优选的，步骤S2中所述的细菌的光密度为OD
600nm
＝0.01～1L/(g
·
cm)。
[0014]优选的，步骤S2中所述的初始菌悬液的浓度为105～10
10
CFU/mL。
[0015]优选的，步骤S3所述pH的范围为5.5～9.2，溶解氧的浓度范围为1～9mg/L，温度的范围为0～60℃。
[0016]优选的，步骤S4中所述的片状TiO2纳米管的管径为5～100nm，长度为1～20μm。
[0017]优选的，步骤S4中所述的LED紫外灯的光强为10～200mW/cm2。
[0018]优选的，步骤S3中所述的光催化的诱导时间为1～10h。
[0019]所述的光催化技术诱导获得小菌落变异体的方法在环境微生物研究领域中的应用。
[0020]本专利技术基于光催化诱导获得细菌小菌落变异体的方法，将保存于超低温冰箱的细菌菌种复苏培养，在恒温培养箱中进行培养至对数生长期，通过调控光催化诱导反应的细菌种类、初始菌悬液浓度、片状TiO2纳米管光催化剂、紫外灯光强以及诱导时间等理化参数对细菌小菌落变异体诱导的影响，诱导获得了细菌小菌落变异体。离心洗涤重悬菌体并经梯度稀释后得到初始菌悬液，一方面通过调整细菌种类，初始菌悬液浓度，pH，溶氧量和温度等诱导理化参数，另一方面调整LED紫外灯的光强，光催化诱导时间等外部条件，综合评估光催化诱导获得细菌小菌落变异体的影响。基于探索的最适合条件下的浓度：培养时间为1～20h，细菌的光密度为OD
600nm
＝0.01～1L/(g
·
cm)，细菌初始原液的浓度为105～10
10
CFU/mL，pH为5.5～9.2，溶解氧浓度为1～9mg/L，诱导温度为0～60℃，催化剂片状TiO2纳米管(管径为5～100nm，长度为1～20μm)，LED紫外灯的光强为10～200mW/cm2，光催化的诱导时间为1～10h，在最适合的条件下为光催化诱导获得细菌小菌落变异体的方法手段。
[0021]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0022]1.本专利技术通过调整初始菌悬液浓度，催化剂片状TiO2纳米管等诱导理化参数，以及通过调整LED紫外灯的光强，光催化的诱导时间，pH，溶解氧和温度等外部条件，可显著提高细菌小菌落变异体的诱导量，其诱导量为10
2.56
CFU/mL以上，最高的细菌小菌落变异体的诱导量可达到约10
5.46
CFU/mL，实现对不同细菌种类的细菌小菌落变异体的光催化诱导，易于大规模在实际环境中推广与应用。
[0023]2.本专利技术使用片状TiO2纳米管的光催化诱导手段，经诱导得到细菌小菌落变异体即为纯细菌溶液，可直接用于进一步的实验室科学研究或其它用途。
附图说明
[0024]图1为实施例1中光催化诱导获得细菌小菌落变异体的诱导量。
具体实施方式
[0025]下面结合具体实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别
说明，本专利技术专利采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。
[0026]实施例1
[0027]1.将大肠杆菌菌种接种到营养肉汤中复苏培养，在0～40℃进行恒温培养，使细菌生长至对数生长期；
[0028]2.将对数生长期的细菌离心后去除上清液得到菌体，用生理盐水洗涤并重悬菌体，最后调整细菌的光密度为1L/(g
·
cm)，用生理盐水经梯度稀释后得到浓度为109CFU/mL的初始菌悬液；
[0029]3.将碳酸氢钠溶液或磷酸溶液添加到初始菌悬液中调节pH至7.2，控制溶解氧浓度为5.5mg/L，放置在恒温箱中控温在25℃，即为模本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种光催化诱导获得细菌小菌落变异体的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将细菌菌种接种到营养肉汤中复苏培养，在0～40℃进行恒温培养，使细菌生长至对数生长期；S2.将对数生长期的细菌离心后去除上清液得到菌体，用生理盐水洗涤并重悬菌体，调整细菌的光密度，用生理盐水进行梯度稀释，得到初始菌悬液；S3.将碳酸氢钠溶液或磷酸溶液添加到初始菌悬液中调节pH至5.5～9.2，控制溶解氧浓度为1～9mg/L，放置在恒温箱中控温在0～60℃，即为模拟环境条件；S4.向模拟环境条件的初始菌悬液中插入片状TiO2纳米管，使用发射波长为365nm的LED紫外灯进行光催化诱导，得到细菌小菌落变异体。2.根据权利要求1所述的光催化诱导获得小菌落变异体的方法，其特征在于，步骤S1中所述的细菌菌种为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌或金黄色葡萄球菌的一种以上。3.根据权利要求1所述的光催化诱导获得小菌落变异体的方法，其特征在于，步骤S1中所述的恒温培养的时间为1～20h。4.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：安太成，蔡仪威，李桂英，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：