一株高产溶葡萄球菌酶的大肠杆菌突变体制造技术

本发明专利技术提供了一种大肠埃希氏菌(Escherichia coil)BL21/(DE3)/pOpt

【技术实现步骤摘要】
一株高产溶葡萄球菌酶的大肠杆菌突变体


[0001]本专利技术属于微生物产酶
，具体涉及一种高产溶葡萄球菌酶的大肠杆菌突变体。

技术介绍

[0002]溶葡萄球菌酶(lysostaphin,Lys)可以专一性地作用于金黄色葡萄球菌细胞壁中的Gly五肽交联桥，从而裂解其细胞壁，对金黄色葡萄球菌具有很好的溶菌杀菌效果。尽管溶葡萄球菌酶在预防和治疗葡萄球菌感染方面有非常大的应用潜力，但由于其生产成本较高，目前仍没有被广泛的应用。
[0003]常压室温等离子体(Atmospheric Room Temperature Plasma，ARTP)诱变系统能够在大气压下产生温度在25
‑
40℃之间的、具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、 OH自由基等)浓度的等离子体射流，来改变目标生物细胞壁和质膜的结构和通透性，进而引起DNA损伤，快速有效地突变细菌、放线菌、微藻、真菌、酵母等微生物。ARTP因其具有温度低，活性粒子浓度高且种类多样、对环境无污染和危害、操作简易、运行成本低廉等优点，已经成为发酵工业获得高产突变菌株的高效方法。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一株高产溶葡萄球菌酶的大肠杆菌突变体。
[0005]本专利技术结合ARTP诱变，对申请号为202210279685.2，专利申请名称为一种利用大肠杆菌产溶葡萄球菌酶的方法，该专利文献中记载的大肠杆菌工程菌 BL21(DE3)/pET22b(+)
‑
Optr/>‑
Lys进行诱变获得了一株胞外溶葡萄球菌酶产量高的突变菌株。
[0006]本专利技术也提供了一种对诱变菌株进行高通量的筛选的方法。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]一种大肠埃希氏菌(Escherichia coil)BL21/(DE3)/pOpt
‑
lys 4
‑
36，保藏日期为2022年5 月23号，保藏机构中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏编号CGMCC No.24960。
[0009]上述大肠埃希氏菌(Escherichia coil)BL21/(DE3)/pOpt
‑
lys 4
‑
36的培养方法，包括如下步骤：
[0010]将大肠埃希氏菌(Escherichia coil)BL21/(DE3)/pOpt
‑
lys 4
‑
36接种于含有氨苄青霉素的 LB培养基中，35
‑
37℃，18
‑
200rpm培养获得大肠埃希氏菌(Escherichia coil)BL21/(DE3)/pOpt
ꢀ‑
lys 4
‑
36。
[0011]根据本专利技术优选的，LB培养基的成分组成为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，余量水，pH值6.7。
[0012]根据本专利技术优选的，氨苄青霉素的终浓度为100μg/mL。
[0013]上述大肠埃希氏菌(Escherichia coil)BL21/(DE3)/pOpt
‑
lys 4
‑
36生产溶葡萄球菌酶的方法，包括如下步骤：
coil) BL21/(DE3)/pOpt
‑
lys 4
‑
36。
[0037]实施例1
[0038]ARTP诱变仪突变大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b(+)
‑
Opt
‑
Lys
[0039]采用ARTP
‑Ⅱ
S诱变育种仪(四川四清源生物科技有限公司，无锡，中国)。主要参数包括：电源P(P＝100W)、气体流量G(G＝10.0slm)、等离子体温度T(T＝20.0℃)。
[0040]将20μL大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b(+)
‑
Opt
‑
Lys菌悬液(106‑
108cells/mL)均匀地铺在已灭菌的金属载玻片上并分别处理0、15、30、45、60、75、90、105和120s，每次处理后，将载玻片转移到含有1mL生理盐水的无菌EP管中洗脱。在获得理想的致死率处理时间条件下，将洗脱液涂布至含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板，在37℃静置培养12h。挑取菌落用于ARTP突变体的初步筛选。结果显示处理时间为90s时能够获得90％的致死率，因此处理时间选定为90s。
[0041]实施例2
[0042]突变体高通量筛选方法的建立
[0043]利用溶葡萄球菌酶的胞外分泌特性，本专利技术建立一种简单的突变体筛选方法，来获得溶葡萄球菌酶高产菌株。此方法的示意图如图1所示。
[0044]一种筛选胞外分泌溶葡萄球菌酶的菌株的方法，包括如下步骤：
[0045](1)BL21(DE3)/pET22b(+)
‑
Opt
‑
Lys菌株经过实施例1中ARTP诱变后，获得的单菌落使用无菌牙签点种于下层添加IPTG终浓度为0.5mM、Amp终浓度为100μg/mL抗性的LB 平板，37℃静置培养12h，制得含筛选菌株的平板。
[0046](2)将金黄色葡萄球菌过夜培养，用磷酸盐缓冲液(100mM,pH 7.0)稀释至OD
600
为1.0，该菌悬液与LB固体培养基以体积比1：100的比例混合，作为含指示菌的上层培养基。将含有指示菌的上层培养基倒入步骤(1)制备的含筛选菌株的平板上，制备上层平板，在37℃下孵育24h。
[0047](3)通过步骤(2)平板上产生的抑菌圈大小进行随机诱变菌株胞外酶活的比较，筛选出高活性的突变株。结果如图2所示，mutant 4为突变菌株BL21(DE3)/pET22b(+)
‑
Opt
‑
Lys 4
‑
36，大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pET22b(+)
‑
Lys胞外不产透明圈，重组菌株(即突变的原始菌株)BL21(DE3)/pET22b(+)
‑
Opt
‑
Lys可以产透明圈，而ARTP诱变后获得的突变株，其抑菌圈呈现不同水平的变化。
[0048]实施例3
[0049]与实施例2的不同之处在于，步骤(1)中点接突变菌种BL21(DE3)/pET22b(+)
‑
Opt
‑
Lys 4
‑
36 后直接，培养24h后，将步骤(2)中含有指示菌的上层培养基倒入步骤(1)制备的含筛选菌株的平板上，制备上层平板，在37℃下孵育24h。结果显示，菌株所产透明圈大小和培养 12h的无明显区别。
[0050]对比例1
[0051]与实施例2的不同之处在于，步骤(1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠埃希氏菌(Escherichia coil)BL21/(DE3)/pOpt
‑
lys 4
‑
36，保藏日期为2022.5.23，保藏机构为中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.24960。2.权利要求1所述大肠埃希氏菌(Escherichia coil)BL21/(DE3)/pOpt
‑
lys 4
‑
36的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将大肠埃希氏菌(Escherichia coil)BL21/(DE3)/pOpt
‑
lys 4
‑
36接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，35
‑
37℃，18
‑
200rpm培养获得大肠埃希氏菌(Escherichia coil)BL21/(DE3)/pOpt
‑
lys 4
‑
36。3.如权利要求1所述培养方法，其特征在于，氨苄青霉素的终浓度为100μg/mL。4.权利要求1所述大肠埃希氏菌(Escherichia coil)BL21/(DE3)/pOpt
‑
lys 4
‑
36生产溶葡萄球菌酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
①
将大肠埃希氏菌(Escherichia coil)BL21/(DE3)/pOpt
‑
lys 4
‑
36培养于含有氨苄青霉素的LB培养基，35
‑
37℃摇床180
‑
200rpm培养11
‑
13h获得种子液；
②
将种子液以体积分数2
‑
3％的比例转接至含有氨苄青霉素的LB培养基中，培养到OD
600
至0.6
...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振上，王婷，刘新利，王家朋，严梦远，朱珂莹，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：