一种大孔刚性琼脂糖凝胶微球的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种大孔刚性琼脂糖凝胶微球的制备方法。其特征是向琼脂糖非均相水溶液中添加环状酸酐使其与琼脂糖链发生单一酰化反应，然后在琼脂糖均相水溶液中发生交联反应，通过温度控制酸酐与琼脂糖链的交联程度，形成的交联琼脂糖溶液通过高压喷雾将形成的液滴喷入冷却的乙酸乙酯溶液中迅速凝固成球，制备得到大孔刚性琼脂糖微球。本发明专利技术所述方法工艺简单，产品孔径可控。所得产品在原有琼脂糖凝胶优良性能的基础上，刚性及孔径大大增加，是一种理想的色谱固定相介质和优良的固定化酶载体，特别是用作液相色谱介质时，可以在较高流速下工作，实现生物大分子的快速、高效分离。分离。分离。

【技术实现步骤摘要】
一种大孔刚性琼脂糖凝胶微球的制备方法


[0001]本专利技术涉及琼脂糖凝胶介质的制备
，尤其涉及一种大孔刚性琼脂糖凝胶微球的制备方法。

技术介绍

[0002]琼脂糖微球由于其固有的中性、亲水性和多孔性，已被广泛用于生物大分子纯化的色谱填料。但琼脂糖凝胶的柔软性使其形成的微球在色谱填料的应用中受到限制。当流量增加时，填充琼脂糖基色谱介质的色谱柱有压缩的趋势，压降将急剧增加。虽然大粒子的使用可以减轻这种影响，但这只能以粒子内传质距离的大幅增加为代价，这对生物大分子的分离是不可取的。在高流速时，其负面影响尤为明显，会导致波段变宽以及分辨率差。因此，迫切需要开发具有增强传质性能的刚性琼脂糖微球，以满足高速色谱的要求。交联是一种常用的提高琼脂糖微球力学强度的方法。它通过交联剂化学结合多糖链来稳定凝胶主链。通常，交联剂是在凝胶颗粒形成后引入的，称为后交联，即交联剂必须在凝胶颗粒内部扩散，才能接近羟基位置。琼脂糖凝胶网络的空间位阻严重阻碍了扩散过程。因此交联效率大大降低，得到的琼脂糖微球硬度不够。此外，作为色谱介质最重要的特性之一，孔结构有助于蛋白质分子通过凝胶网络的运输，并且直接影响色谱分析的效率。影响琼脂糖凝胶微球孔结构的因素很多，例如琼脂糖的性质、交联剂、致孔剂等。第一，琼脂糖溶液的性质对孔结构的形成有很大影响，并且孔径随琼脂糖溶液的浓度而变化，然而，琼脂糖类型的影响，例如分子结构，还没有报道；第二，交联剂对孔结构有重要影响，然而，目前还没有关于交联度影响的报道。第三，成孔剂在孔隙结构中起着重要作用，据报道，通过双乳化程序或使用碳酸钙颗粒作为成孔剂可形成非常大的流动孔。基于琼脂糖层析介质的凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析和亲和层析等分离技术在蛋白、病毒、核酸和多肽等纯化领域同样有很好的效果。此类介质虽然商品化程度较高，但由于技术保密等原因，成熟的制备技术鲜有报道。目前我国在微球制备以及功能化方面的发展还处于探索阶段，国内对此类凝胶微球的需求多依赖进口，价格昂贵，应用成本较高。

技术实现思路

[0003]为了解决这一问题，本专利技术提出预交联法。该方法的特点是在凝胶微球形成前将交联剂加入琼脂糖均相溶液中，可制备出交联剂均匀分布于整个粒子内部的改性琼脂糖微球。除机械稳定性外，色谱性能还与固定相的质粒内传质阻力密切相关。众所周知，在琼脂糖网络中，蛋白质等生物大分子的粒子内扩散是相当缓慢的。而扩大色谱介质的孔径是提高传质效果最有效的方法之一。现行的解决方案是以固体颗粒为致孔剂，采用双乳化法制备琼脂糖微球。但双重乳化形成的孔隙过大，难以控制。而固体致孔剂的缺点是，除非使用高含量的致孔剂，否则难以形成互穿孔结构，而互穿孔结构又会形成力学性能较差的多孔微球。本专利技术发现琼脂糖在温度介导下与环状酸酐发生交联反应，酸酐前体的引入可有效提高琼脂糖凝胶网络的孔径，即实现交联程度及孔径的可控调节，为大孔径刚性琼脂糖微
球这一前沿科学问题提供解决方案。
[0004]本专利技术的目的在于提供一种既保留了琼脂糖的高凝胶强度又具备数百纳米的大孔刚性琼脂糖凝胶微球的制备方法。同时该方法也解决现有致孔方法普遍存在的制备工艺复杂、致孔剂残留等问题。这种大孔刚性琼脂糖凝胶微球在保证原有琼脂糖凝胶优良性能的基础上，孔径大大增加，并且具有优异的机械强度，是一种理想的液相色谱固定相介质和优良的固定化酶载体，特别是用作液相色谱介质时，可以在较高流速下工作，实现生物大分子的快速、高效分离。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供一种大孔刚性琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0006]S1、将琼脂糖分散于去离子水中，配置成第一琼脂糖悬浮液；
[0007]S2、在搅拌条件下，环状酸酐用乙醇溶解成环状酸酐溶液，将环状酸酐溶液逐滴加入至上述第一琼脂糖悬浮液中进行反应得到第二琼脂糖悬浮液，反应期间维持pH8～8.5，反应结束后调节pH至6.5；
[0008]S3、通过加热使第二琼脂糖悬浮液快速完全溶解，然后快速降温进行二次反应，反应期间pH调至7～9；
[0009]S4、反应结束后，采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化，雾化液滴的接收溶剂为冷却的乙酸乙酯溶液；
[0010]S5、采用离心或过滤除去乙酸乙酯溶液，通过洗涤除去琼脂糖微球表面的有机溶剂，最终得到大孔刚性琼脂糖微球。
[0011]进一步，所述S1步骤中，琼脂糖悬浮液的质量浓度为4％～8％。
[0012]进一步，所述S1步骤中，所述琼脂糖在浓度为1.5wt％时的凝胶强度大于1500g/cm2。
[0013]进一步，所述S2步骤中，所述环状酸酐选自顺丁烯二酸酐、反丁烯二酸酐、丁二酸酐及戊二酸酐中的至少一种；
[0014]任选的，所述第一琼脂糖悬浮液中的琼脂糖与环状酸酐的摩尔比为1:1～4:1，琼脂糖以二糖单位计。
[0015]进一步，所述S2步骤中，所述反应为非均相单一酰化反应，反应温度为30～40℃，反应时间为1～2h；
[0016]任选的，所述反应为非均相单一酰化反应，所得琼脂糖在浓度为1.5wt％时的的凝胶强度为900～1300g/cm2。
[0017]进一步，所述S3步骤中，所述二次反应为均相交联反应，反应温度为60～75℃，反应时间为1～2h，反应pH维持8～8.5。
[0018]进一步，所述S3步骤中，所述反应为交联反应，所得琼脂糖在浓度为1.5wt％时的的凝胶强度大于1500g/cm2。
[0019]进一步，所述S4步骤中，采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化步骤中，所述喷雾压力为0.1～0.4MPa。
[0020]进一步，所述S5步骤中，所述的大孔刚性琼脂糖微球的粒径为45～155μm，孔径在100～500nm，耐受压力达到0.1Mpa，最高流速可达180cm/h～300cm/h，排阻极限为200000Da球蛋白。
[0021]本专利技术还提供一种大孔刚性琼脂糖凝胶微球，其特征在于：其由上述制备方法制得。
[0022]所述制备得到的琼脂糖微球孔径取决于琼脂糖的浓度及交联程度，凝胶孔的孔径随琼脂糖浓度的增加而减小，随交联程度的增加而增大。
[0023]与现在技术相比，本专利技术具有如下优点：
[0024](1)本专利技术提供的环状酸酐预交联法制备大孔刚性琼脂糖微球工艺，无需制备复乳体系，无需添加表面活性剂，即可得到大孔刚性结构。该法有效避免了复乳法中致孔过程中由于乳液稳定性差异导致内相液滴融合，引起的孔径过大以及孔径不可控的问题，根据本专利技术提供的方法，可通过温度控制环状酸酐与琼脂糖链的交联程度，进而实现对产品孔径的调控。
[0025](2)与油/水体系不同，本专利技术是利用环状酸酐开环后形成的双羧基与琼脂糖不同糖链中的羟基发生交联反应，该交联反应取代了琼脂糖链在凝胶时氢键的作用，酸酐前体的引入起到空间位阻的作用，使琼脂糖链在形成双螺旋及网络结构时的间距增大，因此，本专利技术只需在水相中反应，无需添加油相，致孔剂及表面活性剂。
[0026](3)本专利技术采本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大孔刚性琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将琼脂糖分散于去离子水中，配置成第一琼脂糖悬浮液；S2、在搅拌条件下，环状酸酐用乙醇溶解成环状酸酐溶液，将环状酸酐溶液逐滴加入至上述第一琼脂糖悬浮液中进行反应得到第二琼脂糖悬浮液，反应期间维持pH8～8.5，反应结束后调节pH至6.5；S3、通过加热使第二琼脂糖悬浮液快速完全溶解，然后快速降温进行二次反应，反应期间pH调至7～9；S4、反应结束后，采用高压喷雾装置将琼脂糖溶液雾化，雾化液滴的接收溶剂为冷却的乙酸乙酯溶液；S5、采用离心或过滤除去乙酸乙酯溶液，通过洗涤除去琼脂糖微球表面的有机溶剂，最终得到大孔刚性琼脂糖微球。2.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述S1步骤中，琼脂糖悬浮液的质量浓度为4％～8％。3.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述S1步骤中，所述琼脂糖在浓度为1.5wt％时的凝胶强度大于1500g/cm2。4.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述S2步骤中，所述环状酸酐选自顺丁烯二酸酐、反丁烯二酸酐、丁二酸酐及戊二酸酐中的至少一种；任选的，所述第一琼脂糖悬浮液中的琼脂糖与环状酸酐的摩尔比为1:1～4:1，琼脂糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖琼，马铭泽，肖安风，翁惠芬，陈俊，陈福泉，杨秋明，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：