用于难破壁病原体分子诊断的参考品及其制备方法和应用技术

本申请涉及一种用于难破壁病原体分子诊断的参考品及其制备方法和应用。所述参考品为重组酵母工程菌，且重组酵母工程菌的染色体上整合有外源的靶病原体基因；所述外源的靶病原体基因随着重组酵母工程菌的染色体稳定遗传。该参考品在结构、性能和成分等各种方面基本接近于待检测的相应病原体的临床样本或培养物，可以充分模拟真菌、分枝杆菌和革兰氏阳性菌等较难破壁的病原体，且所述参考品的制备方法具有操作简单，制备周期短、生成量大、生产成本低、来源和性能足够稳定，使用时可监测样本从处理到检测的全过程，最重要的是能够模拟不易获得的病原体难破的细胞壁，且具有较高的生物安全性，可较好地应用于检测病原体的分子诊断产品中。产品中。产品中。

【技术实现步骤摘要】
用于难破壁病原体分子诊断的参考品及其制备方法和应用


[0001]本申请涉及基因工程
，尤其是涉及一种用于难破壁病原体分子诊断的参考品及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]难破壁病原体包括真菌、分枝杆菌和革兰氏阳性菌等病原体。其中真菌是一种真核生物，通常分为三类，即“酵母菌”(单细胞真菌)、“霉菌”(丝状真菌)和“蕈菌”(大型真菌)。根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部真菌，包括皮肤藓菌、孢子丝菌、念珠菌、曲霉菌、隐球菌、组织胞浆菌、烟曲菌、黄曲菌、黑曲菌、土曲菌等，多数常发生于免疫力低下的患者，引起全身散播性感染，影响预后。目前，已发现了至少150种真菌可使人类致病，侵犯人体的各个脏器。深部真菌病的死亡率仍很高，即使救治成功也需花费大量的经济代价。有资料表明，因真菌感染而死亡的患者能获得生前诊断的不足20％。因此，对真菌快速准确的诊断和鉴定病种，进而对于指导用药是十分重要的。
[0003]目前，真菌感染的常规实验室诊断主要包括真菌涂片、培养、鉴定、药敏试验、血清学鉴定等。这些常规传统的检测方法存在耗费时间而且干扰因素多，而且它们的敏感性和特异性有限。以PCR方法为基础的分子生物学技术已在临床微生物检测领域引起了一场革命。以真菌核酸PCR检测方法成为了真菌感染的最佳诊断工具之一，因此有望研制出各种商品化的真菌快速分子诊断鉴定试剂盒，为临床提供新的快速早期诊断手段，对于指导临床用药和预后评估都有重要的意义。而在分子诊断产品开发过程中，从反应体系的建立，到产品性能的验证，直至定型产品的质控都离不开参考品，试剂盒的质控体系是通过设置各种质控品来实现。由于有些临床样本或培养物的生物传染性及来源有限，如何建立合适的参考品，能充分的模拟真菌是关键。另外，由于真菌细胞壁较厚，结构坚韧，其破壁难度较细菌细胞大，适用于细菌细胞的破壁方法用于真菌细胞破壁的效果不佳。比真菌更难破壁的分枝杆菌(结核分枝杆菌复合群、麻风分枝杆菌及非结核分枝杆菌NTM)，其细胞壁含有大量酯类，干重占比60％。人结核分枝杆菌在干燥痰液中可存活6～8月，通过呼吸道、消化道或皮肤粘膜损伤进入机体，引起肺脏或其它脏器病变。牛型结核分枝杆菌对牛和其它家畜有致病性，能引起牛、马、猪的进行性和致死性结核病，对绵羊和山羊也能引起进行性结核病，对人特别是儿童易感，绝大多数病例受害部位为淋巴结和腹腔器官。许多非结核分枝杆菌菌株为条件致病菌，对常用的异烟肼、链霉素等耐药，但对利福平有一定敏感性，非结核分枝杆菌经治疗后也常出现L型，耐药性增高，有的经多年治疗不愈，且L 型往往因细胞壁脂质缺失不易致敏淋巴细胞，结合素试验可呈阴性。近年来，非结核分枝杆菌病也呈快速增多趋势，播散性的NTM病可侵犯全身多个器官，最常受累器官为肝、淋巴结、胃肠道，其次为肺、骨髓、心、肾亦可累及，NTM病已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题之一。
[0004]由于结核病诊断和NTM诊断的金标准是检测临床样本中是否发现结核分枝杆菌和 NTM菌株，但在临床实际操作中确实有一定的困难，而抗原抗体检测虽然已经被广泛应用，
但其敏感性和特异性受到一定的限制，故人们正在不断寻求一些简单易行、敏感性和特异性均高的检测方法来提高分枝杆菌诊断的准确性。分子诊断技术可从分子水平上证明分枝杆菌的存在，目前使用的方法主要包括：(1)直接同源基因或序列比较方法；(2)间接同源基因或序列比较方法；(3)二代测序技术；(4)基质辅助激光解析电离化/飞行时间质谱技术，这几种方法能够鉴别分枝杆菌至种水平。目前分子诊断技术已成为了鉴别分枝杆菌的主流技术，商业化分子诊断试剂盒简化了操作流程，适合于临床实验室开展。但是，由于分枝杆菌临床样本或培养物的高传染性，加之比真菌更难破壁的特性，如何建立合适的人工制作分枝杆菌分子诊断试剂盒参考品是一大难题。除了真菌、分枝杆菌破壁难外，还有一些革兰氏阳性菌等也难破壁，如金黄色葡萄球菌，是革兰氏阳性菌的代表，为球形，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。无芽孢、无鞭毛，体外培养时一般不形成荚膜，但少数菌株的细胞壁外层可见有荚膜样粘液物质。细胞壁含90％的肽聚糖和10％的磷壁酸，其肽聚糖的网状结构比革兰氏阴性菌致密，染色时结晶紫附着后不被酒精脱色故而呈现紫色，相反，阴性菌的细胞壁肽聚糖层薄、交联度差，脂类含量高，所以紫色复合物被酒精冲掉然后附着了沙黄的红色。因而，这些革兰氏阳性菌也都面临着破壁难的相同问题。
[0005]目前商品化的分子检测试剂盒的质控品大多为临床样本、临床培养物和人工制备样本(基因组DNA、质粒、假病毒等)。这三类作为质控品均有优缺点：(1)临床样本为最优参考品，其包含了所需要基因序列，能评价整个分析过程，但其来源有限，具有生物传染性，可能存在异质性。(2)培养物作为次优参考品，可以连续制备，来源可靠，同样也为完整的病原微生物，可用于模拟真实临床样本，稳定性好。但菌种或病毒株来源有限，部分病原体难以通过培养获得，此外，企业自行制备时，需要相应的资质要求。(3)基因组DNA作为人工合成样本其样本均一、可再生、具有已知的突变位点，但其为非“真实”，不能监测提取过程，还可能发生基因重排或丢失。(4)质粒作为人工合成样本，具有明确的基因序列，易于生产、价格便宜、无感染性而且稳定性好，但其为非“真实”样本，不能监测提取过程。而假病毒也不能模拟真菌、分枝杆菌与革兰氏阳性菌。另外，进行真菌、分枝杆菌与革兰氏阳性菌等难破壁病原体快速诊断时，我们都需要对细胞壁进行破碎，才能从细胞内释放出 DNA，细胞壁破碎是细胞内物质提取和研究的基本步骤，人工制作的参考品须能够模拟难破的细胞壁结构，才能准确对其进行模拟。因此急需要一种可以容易获取、可以大量获得，而且更加接近真菌、分枝杆菌和革兰氏阳性菌等难破壁病原体的人工制作参考品。

技术实现思路

[0006]现有技术中，参考品采用临床样本作为真菌、分枝杆菌和革兰氏阳性菌等难破壁病原体的最优样本，培养物作为次优样本，在研发测试中的重要地位毋庸置疑，但同时受限于来源不稳定，存在潜在风险高等缺点。有些真菌样本难培养(如毛菌)，加之真菌、分枝杆菌和革兰氏阳性菌等的高致病性，限制了患者阳性样本作为天然参考品的应用。这时人工合成样本可展示其实用性将其应用于前期研发测试中。但目前人工合成样本作为参考品均存在很多问题，如基因组DNA、质粒作为参考品均不能监测提取过程。另外，作为真菌、分枝杆菌和革兰氏阳性菌等核酸分子检测的参考品，其来源和性能应足够稳定，使用时可监测样本从处理到检测的全过程，最重要的能够模拟难破的细胞壁，同时应具有较高的生物安全性。
[0007]本申请针对上述问题，提供一种用于难破壁病原体病原体分子诊断的参考品，该参考品在结构、性能和成分等各种方面基本接近于待检测的相应病原体的临床样本或培养物，可以充分模拟真菌、分枝杆菌和革兰氏阳性菌等较难破壁的病原体，且所述参考品的制备方法具有操作简单，制备周期短、生成量大、生产成本低、来源和性能足够稳定，制作更准确，使用时可监测样本从处理到检测的全过程，最重要的能够模拟难破的细胞壁，同时也具有较高的生物安本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于难破壁病原体分子诊断的参考品，其特征在于，所述参考品为重组酵母工程菌，且所述重组酵母工程菌的染色体上整合有外源的靶病原体基因。2.根据权利要求1所述的参考品，其特征在于，所述外源的靶病原体基因随着所述重组酵母工程菌的染色体稳定遗传。3.根据权利要求1或2所述的参考品，其特征在于，所述外源的靶病原体基因在所述重组酵母工程菌中的拷贝数为单拷贝或多拷贝。4.根据权利要求1或2所述的参考品，其特征在于，所述难破壁病原体包括真菌、分枝杆菌和革兰氏阳性菌。5.一种如权利要求1
‑
4中任意一项所述的参考品的制备方法，其包括如下步骤：S1，制备含有所述外源的靶病原体基因的线性化载体；S2，将含有所述外源的靶病原体基因的线性化载体导入到酵母感受态细胞中，获得重组酵母工程菌。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：S3，检测所述重组酵母工程菌的基因组中所述外源的靶病原体基因的插入拷贝数；S4，利用金标准...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓琴，傅成波，乔阳，肖丹，闫玉敬，龚皎，曾滨，
申请(专利权)人：北京博晖创新生物技术集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：