一种半同源群体QTL-seq关联分析实现稳定QTLs精准定位的方法技术

本发明专利技术属于分子遗传学领域，具体涉及一种用于QTLs定位的混合分组分析法（BSA）的最新优化及其应用。首次将优化的BSA测序池构建方案与基于2个不同亲本遗传背景下的NGS

【技术实现步骤摘要】
一种半同源群体QTL
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seq关联分析实现稳定QTLs精准定位的方法


[0001]本专利技术属于分子遗传学领域，具体涉及一种用于QTLs定位的混合分组分析法（BSA）的最新优化及其应用。

技术介绍

[0002]中国人均耕地面积933.33 m2，不足世界人均耕地面积的1/2（安祥生等，2021；Brown et al. 1995）。因此，提高农作物单产一直是育种工作者的重要目标。另一方面，随着深加工产业的不断革新，对农产品品质的要求也不断提高。近年来，分子遗传学的发展与相关QTLs的挖掘为从分子水平上实现作物产量与品质的协同改良提供了新的途径。
[0003]作物的大多数农艺性状是由多基因控制的数量性状（quantitative trait loci，QTL）（Falconer et al. 1996）。传统QTLs鉴定是通过分析其与分子标记的连锁关系来实现的。在此基础上，通过标记辅助选择（marker
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assisted selection，MAS）与遗传转化，我们可以实现对目的表型缺陷品种的改良，加快育种进程（Ashikari et al. 2006）。
[0004]混合分组分析法（Bulked segregant analysis，BSA）是基于近等基因系（Near Isogenic Lines，NILs）分析法推绎。杂交子代群体进行表型分离分析，选择目的表型具有极端值的相同数量单株提取DNA进行等摩尔浓度混合完成2个DNA混池构建。混池间存在多态性的分子标记便与目标性状的主效QTLs紧密连锁。1991年，法国的生物学家Michelmore首次将BSA技术应用到莴苣的霉病抗性基因定位，最终鉴定到3个与霉病抗性基因紧密连锁的3个分子标记（Michelmore et al. 2006）。
[0005]在最初的BSA应用中，能够鉴别亲本基因组变异的标记数量仍是主要限制因素，且基因分型工作也较为繁琐。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）标记在丰度与多态性方面具有明显优势。随着新一代测序技术（next
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generation sequencing，NGS）的发展，我们能够快速分析作物的全基因组，大大提高了SNP发掘效率，也推进了BSA技术的应用，并且先后催生了SHOREmap（Schneeberger et al. 2009）、X
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QTL（Ehrenreich et al. 2010）、NGM（Austin et al. 2011）、Mutmap（Abe A et al. 2012）、MutMap
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Gap（Takagi H et al. 2013）、MutMap+（Rym F et al. 2013）以及QTL
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seq（Takagi H et al. 2013）等一系列结合高通量测序的混合分组分析法（Bulked segregant analysis combined with next
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generation sequencing，NGS
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BSA）。
[0006]SHOREmap与X
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QTL BSA测序池的构建需要大量的混池样本，这就要求子代分离群体的样本容量足够大。因此，这两种方法只适合对微生物或者生育期较短的作物进行分析。对于大宗作物而言，并不符合育种实践，在应用方面具有局限性。
[0007]NGM是一种基于纯合性定位的NGS
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BSA。根据遗传连锁不平衡原理，NGM将相对纯合的基因组区域作为目的基因候选区间，并通过计算区间内每个SNP的变异频率（CHD）缩小目的区间。与SHOREmap与X
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QTL相比，NGM进一步提高了定位精度。此外，NGM无需构建高代群体，而且群体容量不必过大，可以应用于一般农作物，不足之处是其只适合隐性基因定位。
[0008]MutMap首次用SNP
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index替代CHD计算等位基因频率。尽管MutMap在定位单基因控制的隐性性状上也非常高效，但其仍无法解决候选位点存在较长结构变异（structural variation，SV）而引起的假阴性问题。MutMap
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Gap收集了亲本无法准确比对到参考基因组的测序数据（unmapped reads），随后补测了这部分数据，并将其与侧翼序列进行了de novo组装。将de novo序列替换参考基因组对应序列后可重新作为新的参考基因组。在分析非模式作物时，MutMap
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Gap尤为适用。MutMap+则不需要突变体与野生型亲本进行回交，而是选择杂合野生型样本反复自交3代以上获得的分离群体用于分析。这可以绕开突变型与野生型回交的步骤，从而解决由于人工诱变导致植株早期致死而无法完成群体构建的情况。MutMap技术体系（MutMap，MutMap
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Gap，MutMap+）以其高效、快速、准确等优点成为定位作物重要性状主效QTLs的有效方法。突变型亲本与野生型亲本遗传背景差异很小，可以有效减小杂交优势的影响，子代表型评价精确，混池构建效率较高。但是，每种作物的诱变条件都需要进行研究，从而增加了工作量。但是，基因组发生突变的位点是随机的，无法实现作物的定向改良，这是MutMap技术体系的最大缺陷。
[0009]QTL
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seq选择目标性状存在显著差异的亲本构建F2分离群体。将极端池Illumina测序数据分别比对到参考基因组，SNP
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index值相减获得
△
SNP
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index，将具有统计学意义的SNP高密区被定义为与目的性状相关的主效QTLs。QTL
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seq不仅减少了SHOREmap与X
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QTL的工作量，而且弥补了NGM与MutMap技术体系的应用局限，使得NGS
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BSA应用从质量性状扩展到数量性状，具有更加重要的意义。为进一步提高QTLs定位的分辨率，由QTL
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seq又衍生出GPS（Wang C et al. 2019）与PCAMP（Yang X et al. 2019）。两者分别构建3与4个BSA测序池，分组计算
△
SNP
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index，并将重叠区间作为最终目的基因候选区间。GPS与PCAMP是QTL
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seq在技术方面的完善与应用方面的扩展，将NGS
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BSA应用迅速从模式植物拓展到了非模式植物。QTL
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seq方法提出后，引起了极大关注，并越来越多地应用于QTLs定位，但仍然有其局限性。
[0010]首先，所有NGS
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BSA技术都涉及分离群体的构建及测序池样本的选择。构建作图群体的杂交亲本遗传背景一般差异较大。在低代分离群体中，基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种半同源群体QTL
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seq关联分析实现稳定QTLs精准定位的方法，其包括如下步骤：1）选择表型值较高或者较低的作物纯系品种作为父本M，与2个表型值与M差异较大且遗传背景彼此不同的母本A和B分别进行杂交，称为A/M与B/M；2）A/M与B/M 半同胞F1单株分别通过自交构建2个半同源F2群体，F2单株继续自交获得F
2:3
株系；3）对于每个F2与F
2:3
群体，分别选择具有极端表型值的单株/株系组成低池L
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pool与高池H
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pool，其仅仅指植株样本混池，而非DNA样本混池；4）基于以下原则构建测序池bulk：2个DNA混池bulks分别应该包含与目的表型相关的不同等位基因，并且是纯合的，其中F
2 pools中目的表型具有极端表型值的样本，其F
2:3
株系也应被分配到株系群体相同的pools中，即该株系中各单株的目的表型同样具有极端值且彼此间不存在大的变异；从2个半同源F2群体的L
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pool与H
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pool中，分别选择相同数量的满足以上条件的F2子代进行DNA提取并分别等摩尔浓度混合，由此完成4个BSA测序池的构建，分别为A/M L
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bulk、A/M H
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bulk、B/M L
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bulk与B/M H
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bulk；5）将4个BSA测序池连同3个亲本分别进行全基因组测序，并对raw data进行质控处理，其中子代及亲本共7个库的clean data分别与参考...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓宇，袁有禄，张小微，龚举武，葛群，范道冉，石玉真，刘爱英，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：