用于聚糖唾液酸化的酶制造技术

本文描述了融合蛋白，例如包含ST6Gal1或B4GalT1的酶活性部分的融合蛋白，以及用于产生该融合蛋白的方法、编码该融合蛋白的核酸分子、包含该核酸分子的载体和包含该载体的宿主细胞。本文还描述了使免疫球蛋白G(IgG)抗体唾液酸化的方法。液酸化的方法。液酸化的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于聚糖唾液酸化的酶
[0001]优先权要求
[0002]本申请要求2020年2月25日提交的美国临时申请序列号62/981,293和2020年5月19日提交的美国临时申请序列号63/026,927的权益。上述临时申请的全部内容以引用方式并入本文。


[0003]本公开涉及融合蛋白，例如包含ST6Gal1或B4GalT1的酶活性部分的融合蛋白，以及用于产生该融合蛋白的方法、编码该融合蛋白的核酸分子、包含该核酸分子的载体和包含该载体的宿主细胞。本文还描述了使免疫球蛋白G(IgG)抗体唾液酸化的方法。

技术介绍

[0004]由人供体的混合血浆(例如，来自至少1,000个供体的混合血浆)制备的静脉内免疫球蛋白(IVIg)用于治疗各种炎性疾病。然而，IVIg制剂具有不同的限制，诸如功效可变、临床风险、高成本和供给有限。不同的IVIg制剂在临床上经常被当作可互换的产品，但众所周知，存在产品制剂的显著差异，这可影响在所选临床应用中的耐受性和活性。在当前的最大给药方案中，在许多情况下仅获得部分且不持续性的响应。此外，与高体积IVIg治疗相关联的长输注时间(4小时至6小时)会消耗输注中心的大量资源，并且不利地影响患者报告的结果，诸如生活的便利性和质量。
[0005]对Fc结构域唾液酸化的重要抗炎作用的鉴定已经呈现出开发更有效的免疫球蛋白疗法的机会。可商购获得的IVIg制剂通常在所存在的抗体的Fc结构域上表现出低水平的唾液酸化。具体地讲，它们在Fc区上表现出支链聚糖的低水平二唾液酸化。
[0006]Washburn等人(《美国国家科学院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences),USA 112:E1297
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E1306(2015))描述了一种受控的唾液酸化工艺，以生成高度四
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Fc
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唾液酸化的IVIg，并且表明该工艺得到具有一致增强的抗炎活性的产物。

技术实现思路

[0007]本文描述了用于制备具有非常高的Fc唾液酸化水平的免疫球蛋白G(IgG)的方法。本文描述的方法可以提供高唾液酸化IgG(hsIgG)，其中Fc结构域上大于70％的支链聚糖在两个分支上(即，在α1,3分支和α1,6分支上)均被唾液酸化。HsIgG含有IgG抗体亚型的多样性混合物，其中IgG1抗体是最普遍的，接着是IgG2。抗体的多样性非常高，因为原材料是从数百个或几千个供体混合的IgG抗体。用于制备hsIgG的IgG抗体可以例如从人类混合血浆(例如，来自至少1,000至30,000个供体的混合血浆)获得。另选地，可以使用IVIg，包括可商购获得的IVIg来制备hsIgG。hsIgG在Fc区上的支链聚糖上的唾液酸水平远高于IVIg。这产生在结构和活性两方面不同于IVIg的组合物。HsIgG可如WO2014/179601或Washburn等人(《美国国家科学院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences),USA 112:E1297
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E1306(2015))中所述制备，两者均据此以引用方式并入。
[0008]本文描述了用于制备hsIgG的改进方法。
[0009]在高唾液酸化IgG中，Fc区上至少60％(例如，65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、94％、95％、97％、98％至100％且包括100％)的支链聚糖通过NeuAc
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α2,6
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Gal末端键进行二唾液酸化(即，在α1,3分支和α1,6臂两者上)。在一些实施方案中，Fc区上少于50％(例如，少于40％、30％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％)的支链聚糖通过NeuAc
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α2,6
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Gal末端键进行单唾液酸化(即，仅在α1,3分支上或仅在α1,6分支上唾液酸化)。
[0010]在一些实施方案中，多肽源自血浆，例如人血浆。在某些实施方案中，多肽绝大多数是IgG多肽(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或它们的混合物)，但是可存在痕量的其它多肽，含有痕量的其它免疫球蛋白亚类。
[0011]如本文所用，术语“抗体”是指包括至少一个免疫球蛋白可变区，例如，提供免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列的氨基酸序列的多肽。例如，抗体可以包括重(H)链可变区(在本文中缩写为V
H
)和轻(L)链可变区(在本文中缩写为V
L
)。在另一个示例中，抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体”涵盖抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab、F(ab')2、Fd、Fv和dAb片段)以及完整抗体，例如，IgA、IgG、IgE、IgD、IgM类型(以及它们的亚型)的完整免疫球蛋白。免疫球蛋白的轻链可以是κ型或λ型。
[0012]如本文所用，术语“恒定区”是指对应于或源自抗体的一个或多个恒定区免疫球蛋白结构域的多肽。恒定区可以包括以下免疫球蛋白结构域中的任何或所有免疫球蛋白结构域：C
H
1结构域、铰链区、C
H
2结构域、C
H
3结构域(源自IgA、IgD、IgG、IgE或IgM)和C
H
4结构域(源自IgE或IgM)。
[0013]如本文所用，术语“Fc区”是指两个“Fc多肽”的二聚体，每个“Fc多肽”包括除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体恒定区。在一些实施方案中，“Fc区”包括通过一个或多个二硫键、化学接头或肽接头连接的两个Fc多肽。“Fc多肽”是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，并且还可包括这些结构域的柔性铰链N
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末端的部分或全部。对于IgG，“Fc多肽”包含免疫球蛋白结构域Cgamma2(Cγ2)和Cgamma3(Cγ3)以及Cgamma1(Cγ1)与Cγ2之间的铰链的下部。虽然Fc多肽的边界可以变化，但通常将人IgG重链Fc多肽定义为包含从T223或C226或P230开始至其羧基末端的残基，其中根据如Kabat等人(1991，国家卫生研究院出版(NIH Publication)91
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3242，弗吉尼亚州斯普林菲尔德国家技术信息服务中心(National Technical Information Services,Springfield,VA))的EU索引进行编号。对于IgA，Fc多肽包含免疫球蛋白结构域Calpha2(Cα2)和Calpha3(Cα3)以及Calpha1(Cα1)与Cα2之间的铰链的下部。Fc区可以是合成的、重组的或由天然来源诸如IVIg生成。
[0014]如本文所用，“聚糖”是糖，其可以是糖残基的单体或聚合物，诸如至少三种糖，并且可以是直链或支链的。“聚糖”可包括天然糖残基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：N端信号序列；和人α
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2,6
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唾液酸转移酶1(ST6Gal1)的酶活性部分。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述ST6Gal1的酶活性部分包含SEQ ID NO:4。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述ST6Gal1的酶活性部分由SEQ ID NO:4组成。4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述信号序列是N端天青杀素信号序列。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述天青杀素信号序列包含MTRLTVLALLAGLLASSRA(SEQ ID NO:30)。6.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述天青杀素信号序列由MTRLTVLALLAGLLASSRA(SEQ ID NO:30)组成。7.根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白还包含亲和标签。8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述亲和标签选自由以下组成的组：聚组氨酸、谷胱甘肽S
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转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白、链霉亲和素标签(例如，Trp
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Ser
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His
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Pro
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Gln
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Phe
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Glu
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Lys(SEQ ID NO:31))、FLAG标签(例如，DYKDDDDK(SEQ ID NO:32))、生物素标签以及它们的组合。9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述聚组氨酸标签选自由以下组成的组：HHHH(SEQ ID NO:11)、HHHHH(SEQ ID NO:12)、HHHHHH(SEQ ID NO:13)、HHHHHHH(SEQ ID NO:14)、HHHHHHHH(SEQ ID NO:15)、HHHHHHHHH(SEQ ID NO:16)和HHHHHHHHHH(SEQ ID NO:17)。10.根据权利要求7至9中任一项所述的融合蛋白，其中所述亲和标签位于朝向所述ST6Gal1的酶活性部分的N端侧的位置。11.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述N端信号序列包含MTRLTVLALLAGLLASSRA(SEQ ID NO:30)，并且所述ST6Gal1的酶活性部分包含SEQ ID NO:4。12.根据权利要求11所述的融合蛋白，所述融合蛋白还包含六聚组氨酸标签。13.根据权利要求12所述的融合蛋白，其中所述六聚组氨酸标签介于所述N端信号序列与所述ST6Gal1的酶活性部分之间。14.根据权利要求13所述的融合蛋白，所述融合蛋白由SEQ ID NO:6组成。15.一种核酸分子，所述核酸分子编码根据权利要求1至14中任一项所述的融合蛋白。16.一种载体，所述载体包含根据权利要求15所述的核酸分子。17.根据权利要求16所述的载体，所述载体还包含可操作地连接到编码所述融合蛋白的所述核酸的启动子。18.根据权利要求16所述的载体，其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。19.一种宿主细胞，所述宿主细胞用根据权利要求16所述的载体稳定地转化。20.根据权利要求17所述的宿主细胞，其中所述细胞是人胚肾(HEK)细胞或其衍生物。21.根据权利要求20所述的宿主细胞，其中所述细胞是HEK衍生物HEK293。22.一种用于产生多肽的方法，所述方法包括：在容许所述融合蛋白的表达的条件下在培养基中培养根据权利要求19至21中任一项所述的宿主细胞；以及
从所述培养基中分离所述融合蛋白。23.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：N端信号序列；和人β
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1,4
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半乳糖基转移酶(B4GalT1)的酶活性部分。24.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述B4GalT1的酶活性部分包含SEQ ID NO:43。25.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述B4GalT1的酶活性部分由SEQ ID NO:43组成。26.根据权利要求23至25中任一项所述的融合蛋白，其中所述信号序列是N端天青杀素信号序列。27.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述天青杀素信号序列包含MTRLTVLALLAGLLASSRA(SEQ ID NO:30)。28.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述天青杀素信号序列由MTRLTVLALLAGLLASSRA(SEQ ID NO:30)组成。29.根据权利要求23至28中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：动量制药公司，
类型：发明
国别省市：